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{"created":"2022-01-31T14:02:29.826111+00:00","id":"lit19258","links":{},"metadata":{"alternative":"Zeitschrift f\u00fcr Physiologische Chemie","contributors":[{"name":"Pribram, Bruno Oskar","role":"author"}],"detailsRefDisplay":"Zeitschrift f\u00fcr Physiologische Chemie 71: 472-478","fulltext":[{"file":"p0472.txt","language":"de","ocr_de":"\u00dcber die Anwendbarkeit der Estermethode bei Stoffwechsel\nversuchen!\nVon\nDr. Bruno Oskar Pribram, Wien.\n(i)i'r Rcilaklio\u00bb zugegaiisrt\u2019t\u00ef am 18. Marz HUI.)\nSoit den Arbeiten Emil Fischers \u00fcber die Aminos\u00e4ure-ester, die die Verwendbarkeit derselben zur Trennung und Identifizierung der Aminos\u00e4uren, den Eiwei\u00dfbausteinen bewiesen, ist diese Esterinethode ganz allgemein in Anwendung, wenn es sich darum handelt, Aminos\u00e4uren aus einem Gemisch zu isolieren und zu erkennen.\nDin Eiwei\u00dfsloffweehselforscher, die seit Jahren bem\u00fcht sind, die Frage zu entscheiden, wie weit Eiwei\u00df im Magen-darmkanal unter dem Einflu\u00df der Verdauungsfermente abgebaut wird, haben diese Methode ebenfalls benutzt, um nachzuweisen, ob Aminos\u00e4uren als Stoffwechselprodukte im Verdauungstrakt auf treten.\nZu diesem Zwecke wird das Verdauungsgemisch unter vermindertem Druck eingedampft und mit Alkohol und Salzs\u00e4uregas nach der Fischersclien Vorschrift zwei-oder mehrmals verestert, eventuell entstandene Ester aus den Chlor-\n\u00bb\nhydratc.n freigemacht, ausge\u00e4thert und der Destillation unterworfen. Die so gereinigten und fraktionierten Ester werden nach den bekannten Methoden, die ja f\u00fcr einige Aminos\u00e4uren sehr verl\u00e4\u00dflich und verh\u00e4ltnism\u00e4\u00dfig einfach sind, identifiziert.\nNach den grundlegenden Arbeiten Abderhaldens k\u00f6nnen zum Nachweis proteolytischer Fermente in einwandfreier Weise Polypeptide verwendet werden. Eine Spaltung durch Fermente l\u00e4\u00dft sich besonders sch\u00f6n an Tyrosinpeptiden durch das Aus?-krystallisieren des Tyrosins, an Tryptophanderivaten durch das Auftreten der Bromwasserreaktion zeigen. Aber auch hier wird oft die Estermethode angewandt. Will man z. B. Fermente in den Faeces nachweison, so setzen manche Forscher zu dem Extrakt ein Polypeptid, am einfachsten ein solches, das das loirht nachweisbare Glykokoll enth\u00e4lt. Das Ganze wird unter","page":472},{"file":"p0473.txt","language":"de","ocr_de":"i Wr Anwendbarkeit der hsterm^lhode bei Stoffwecbselversucben. i/H\n.Toiiiol eine\tim Brutschrank gelassen, hierauf (unge-\nd\u00e4mpft, verestert und das eventuell aus* dem Polypeptid abgespaltene Glykokoll als Esterchlorhydrat gefunden.\nEs sei mir nun gestattet, einige-Versuche hier zu ver\u00f6ffentlichen. die ich, urspr\u00fcnglich ein ganz anderes Ziel verfolgend, im Jahre 1908 ausf\u00fchrte* Das Resultat, der Versuche wurde damals nicht bekannt gegeben, weil ich den Zweck, den ich damals anstrebte, auf diesem Wege nicht erreichte und f\u00fcr mich das Resultat also ein negatives war.Dennoch\nglaube ich sie heute ver\u00f6ffentlichen zu sollen,. weil,sie einen Beitrag zur Anwendbarkeit der Estermethode bei Stoffwechsel-Versuchen liefern.\nIn kurzem sei das Resultat der Versuche vorweg genommen. Es wurde gefunden, da\u00df Eiwei\u00dfk\u00f6rper, in absolutem\nAlkohol suspendiert und mit Salzs\u00e4uregas behandelt, gespalten werden. Wenn man also nach einer Eiwei\u00dfmahlzeit den Magen aushebert und den Inhalt auf die oben angef\u00fchrte Weise auf Aminos\u00e4uren untersucht und solche lindet, so besteht die Gefahr, da\u00df diese Aminos\u00e4uren erst bei der Veresterung aus Eiwei\u00df entstanden und \u00fcberhaupt keine Verdauungsprodukte sind. Diese M\u00f6glichkeit besteht selbstverst\u00e4ndlich bei allen bisher in diesem Sinne ausgef\u00fchrten Versuchen.\nDie Tatsache, da\u00df die Spaltung in absolut alkoholischer L\u00f6sung erfolgte, legte \u2018den Gedanken nahe, da\u00df diese in der \\\\ eise vor sich geht, da\u00df an die Stelle der Peptidbindungen die G^HjOH-Gruppe tritt, da\u00df es sich also um eine Alkohol y sc handelt. Sp\u00e4tere Versuche widerlegten diese Ansicht allerdings lind machten es wahrscheinlich, da\u00df die C2IIT)H;Gruppe erst sekund\u00e4r im Sinne einer Veresterung eintritt, nachdem vorher selbst durch 8 geringe Mengen nicht auszuschlie\u00dfenden Wassers eine Hydro-lyse erfolgt ist. Da das aufgenommene Wasser bei der darauffolgenden Veresterung wieder frei wird, so l\u00e4\u00dft es sich ganz gut verstehen, warum nur geringe Mengen davon zur Spaltung n\u00f6tig sind:\nIch m\u00f6chte, ehe ich auf den experimentellen Teil ein-gehe. noch auf einen Punkt hinweisen, der mir von Wichtigkeit zu sein scheint, gerade in bezug auf die Stoffwechselversuche","page":473},{"file":"p0474.txt","language":"de","ocr_de":"474*\nBruno Oskar Pribram,\nund die Schl\u00fcsse, die man aus dem Auftreten beziehungsweise Fehlen bestimmter Aminos\u00e4uren zu ziehen geneigt sein k\u00f6nnte. Iiei den Spaltungsversuchen, die ich mit Gelatine an^ellte, war es auffallend, da\u00df ich kein Glykokoll' naehweisen konnte, w\u00e4hrend Prolin, Alanin, Phenylalanin usw. zu identifizieren waren. Dies war um so bemerkenswerter, als ganz allgemein Gelatine mehr Glykokoll enth\u00e4lt .als andere Aminos\u00e4uren und ich bei einer gew\u00f6hnlichen Hydrolyse dieser Gelatine den Gehalt mit 12 \u00b0/o bestimmte. Die Ursache war, wie sich sp\u00e4ter herausstellte, allein darin zu suchen, da\u00df der am leichtesten verseifbare Glykokollester eben verseift oder auch m\u00f6glicherweise das Glykokoll \u00fcberhaupt noch nicht verestert war: und wie unten gezeigt werden soll, waren es keine bedeutenden Mengen Wassers, die dies bewirkten. Bei einem andern Versuch wurde Glykokoll als unverestertesGlvkokollchlorhvdrat gefunden. Urst ein nochmaliges Verestern gab die normale Ausbeute an Ks ter chlorhydrat.\nIch verweise hier auch auf die Publikation von Dr. Pfannl, der meine Versuche seinerzeit, fortgesetzt hat.1)\n%\nExperimenteller Teil.\nIch will nur einen ganz kleinen Teil der in sehr.gro\u00dfer Anzahl ausgef\u00fchrten Versuche anf\u00fchren, da dies f\u00fcr den vorliegenden Zweck voll- zu gen\u00fcgen scheint.\nAls Vorversuch wurden 20 g lufttrockenes Ovalbumin (pulv. suhl. Merk) in der zehnfachen Menge absoluten Alkohols suspendiert und ein Str\u00f6m von scharf getrocknetem Salzs\u00e4uregas eingeleitet.\t\u00bb\nSchon nach kurzer Zeit trat Violett-, sp\u00e4ter Braunf\u00e4rbung auf, analog den farbent\u00f6nen bei der Hvdrolyse. Nach zirka l Stunde war vollst\u00e4ndige L\u00f6sung eingetreten, die einsetzte, Mmic sich der Alkohol zu w\u00e4rmen begann. Nun wurde noch durch eine weitere Stunde aut dem W^asserbade zum Sieden erhitzt. Bedeutend schneller erfolgte die L\u00f6sung, wenn mit Salz-s\u00e4uregas vorher ges\u00e4ttigter Alkohol verwendet wurde.\n) Sitzungsberichte der Kaiserl. Akademie d. Wissenschaften. Wien. Uez. UH#,1.-und Monatshefte f. Chem., Bd. XXXI. S. Hl.","page":474},{"file":"p0475.txt","language":"de","ocr_de":"Lber Anwendbarkeit der Estermethode bei Stoffwechselversuchen. 475\nA' '\t#\nDas Spaltungsgemisch wurde 'filtriert. Der R\u00fcckstand erwies sich als reim anorganisch und chloratnmonhaltig, ein Beweis daf\u00fcr, da\u00df genau wie bei der Hydrolyse Ammoniak abgespalten wurde.\nDie L\u00f6sung wurde unter vermindertem Druck eiugedampft, die Ester nach. E. Fischers Methode mit Kaliumcarbonat\nund Natronlauge in Freiheit gesetzt und mit \u00c4ther aufgenommen.\nDie Menge an Rohestern betrug 7 g oder 35\u00b0/o.\nEin \u00e4hnliches Resultat gab eine Spaltung von 10 g Casein. Es wurden hiebei 3 g Rohester erhalten.\nDer Versuch wurde bei Gelatine wiederholt in der Absicht, die Menge entstandenen Glykokollesterchlorhydrates zu bestimmen.\nDie L\u00f6sung erfolgte diesmal etwas schwerer, die Dauer der Spaltung wurde daher unter Erw\u00e4rmen auf dem Wasserbade bis auf 8 Stunden ausgedehnt. Die L\u00f6sung wurde nach dem Filtrieren \u2014 der R\u00fcckstand erwies sich als reines Galeium-sulfat \u2014 auf ca. 60 cmm eingeengt, mit einem Kryst\u00e4ilchen Glvkokollesterchlorhydrat geimpft und in den Eisschrank gestellt. Es zeigte sich auch nach mehrmaligem Einengen keine Kristallisation von Glvkokollesterchlorhydrat.\nHierauf wurden die Ester mit Kaliumcarbonat und Natronlauge in Freiheit gesetzt und destilliert. Einleiten von Salzs\u00e4uregas konnte auch im Destillat keine Abscheidung bewirken. Im \u00fcbrigen betrug die Esterausbeute wieder 30\u00b0/o an Rohesteni.\nBei einer Wiederholung des Versuches mit 200 g getrockneter Gelatine ergab sich folgendes. Die Trocknung hatte bewirkt, da\u00df die Spaltung bedeutend langsamer vor sich \u00a3ing. Eine Abscheidung von Glvkokollesterchlorhydrat aus dem Spaltungsgemisch konnte auch hier nach der gew\u00f6hnlichen Verarbeitung nicht erzielt werden. Dagegen konnte nach der Destillation der Ester in der ersten Fraktion Glykokoll nachgewiesen werden. Es wurde Salzs\u00e4uregas eingeleitet, worauf eine geringe Krystallisation eintrat. Die Krystalle schmolzen\nbei 144\u00b0, den Schmelzpunkt des Glvkokollesterchlorhvdrates.\n* \u2022\nDie Menge war allerdings sehr gering und stand in keinem","page":475},{"file":"p0476.txt","language":"de","ocr_de":"Verh\u00e4ltnis zur Ausbeute an den \u00fcbrigen Estern, so da\u00df ich damals verleitet war. Schl\u00fcsse zu ziehen, die sich als nicht zutreffend erwiesen. Der Grund lag nicht, wie sp\u00e4tere Versuche zeigten, in einer unvollst\u00e4ndigen Spaltung, sondern in einer unvollst\u00e4ndigen Veresterung. Es zeigte sich n\u00e4mlich, da\u00df, wenn man das Gemisch unter vermindertem Druck zum Sirup einengte und mit absolutem Alkohol und Salzs\u00e4ure neu veresterte, die Ausbeute dieselbe war. wie bei der gew\u00f6hnlichen Hydrolyse (Pfannl 1. c.i.\nIch bemerke, da\u00df man aus dem Nachweis der Bildung von \u00c4thylchlorid den Schlu\u00df ziehen mu\u00dfte, da\u00df das hierbei im Spaltungsgemische entstehende Wasser die Verseifung bewirkt.\nWenn ich die allergr\u00f6\u00dfte Vorsicht anwandte, um jede Spur von 1\u00c70 auszuschlie\u00dfen, erfolgte die Spaltung auch, nur in bedeutend l\u00e4ngerer Zeit.\nGetrocknet wurde in folgender Weise: Zun\u00e4chst wurden die k\u00e4uflichen Gelatinebl\u00e4tter im Vakuumtrockenschrank aut 100\u00b0 erhitzt; die spr\u00f6de gewordenen Bl\u00e4tter in einem Leinentuche zu einem feinen Pulver zerdr\u00fcckt und zerrieben und dieses Pulver abermals im Vakuum bei 100\u00b0 zur Gewichtskonstanz getrocknet. Der absolute Alkohol war von mir \u00fcber metallischem Calcium destilliert, das Salzs\u00e4uregas durch drei Schwefels\u00e4urewaschflaschen getrocknet. Das ganze System wurde noch durch Aufsetzen eines Chlorcalciumrohres auf den R\u00fcckflu\u00dfk\u00fchler gegen das Eindringen von Feuchtigkeit gesch\u00fctzt. Die Spaltung erfolgte trotzdem ganz glatt innerhalb von \u00bbs Stunden. Die Dauer des Prozesses war bei meinen Versuchen also bedeutend l\u00e4nger als die einer gew\u00f6hnlichen Veresterung. Auch die Temperatur wurde h\u00f6her gehalten. Doch sei bemerkt, da\u00df auch schon beim gew\u00f6hnlichen Einleiten von Salzs\u00e4ure in das Gemisch partielle Spaltung eintrat, sowie der Alkohol mit Salzs\u00e4ure ann\u00e4hernd ges\u00e4ttigt war und sich erw\u00e4rmte. Mir kam es damals darauf an, die Spaltung quantitativ zu bewerkstelligen. Bei Verdauungsversuchen, wo es sich schon um das Auftreten geringer Mengen von Aminos\u00e4uren handelt, besteht die oben erw\u00e4hnte M\u00f6glichkeit der Herkunft","page":476},{"file":"p0477.txt","language":"de","ocr_de":"\u00dcber Anwendbarkeit der Estermethode bei Stoffwechselversuchen. 477\nderselben aus durch Veresterung gespaltenem Eiwei\u00df daher trotz der etwas differenten Verh\u00e4ltnisse.\nBedeutend schneller geht der Proze\u00df der Spaltung vor sich bei einem Feuchtigkeitsgehalt von etwa 5 \u00b0;0 : und dies d\u00fcrften im besten Fall die Verh\u00e4ltnisse sein, wie sie bei Verdauungsgemischen vorliegen.\nLs wurden 360 g scharf getrocknete Gelatine mit genau 95 \u00b0/o igem Alkohol \u00fcbergossen und Salzs\u00e4ure eingeleitet. Die L\u00f6sung der Gelatine erfolgte ziemlich schnell. Die Spaltung erwies sich als vollst\u00e4ndig, die Veresterung unvollst\u00e4ndig.\nBeim Stehen im Eisschrank zeigte sich bald Krystallisation. Der Schmelzpunkt der Krystalle differierte aber von dem des Glvkokollesterchlorhydrates. Er war scharf bei 184\u00b0.\nDie Analyse identifizierte sie als unverestertes Glykokoll-\nchlorhydrat.\tC\tH\tN \u2022\tCI\nGefunden f\u00fcr:\t21,78\t5,3\t12,75\t31,32\nBerechnet f\u00fcr C.2HcN02C1:\t21.51\t5,4\t12,55\t30,7.\n\"\t'\ti\t' 7 \u2019\nDie Identifizierung wurde, da der K\u00f6rper in der Literatur bisher nicht beschrieben ist, in der Weise vervollst\u00e4ndigt, da\u00df\naus 5 g Glykokollesterchlorhydrat durch Verseifen mit Salzs\u00e4ure das Chlorhydrat dargestellt wurde. Dieses zeigte denselben Schmelzpunkt mit 184\u00b0.\nIch will von den vielen ausg\u00e8f\u00fchrten Versuchen nur Hoch\neinen beschreiben, der ergibt, da\u00df bei zweimaligem Verestern die Ausbeute dieselbe ist, wie bei der gew\u00f6hnlichen Hydrolyse.\n460g ungetrocknete Gelatine wurden in 3 Litern 97\u00b0/oigen Alkohols durch 10 Stunden gespalten. Da die Gelatine 15 \u00b0/o Wasser enthielt, so handelte es sich in diesem Falle also abermals um einen Feuchtigkeitsgehalt von 5\u00b0/o. Das Spaltungsgemisch wurde eingedampit und abermals verestert.\nAn Glykokollesterchlorhydrat wurden 85 g gefunden, d. i. ca. 11,5\u00b0/o Glykokoll. 12,2\u00b0/o fand ich bei einer gew\u00f6hnlichen Hydrolyse derselben Gelatine.1) .\nDie \u00fcbrigen Ester wurden diesmal mittels der Ammoniakmethode in Freiheit gesetzt. Die Destillation ergab:\n\u2018) Pribram. Sitzungsber. d. Kaiscrl. Akad.. Wien. Dez.. 190\u00ceJ, und Monatsh. f. Chem., Bd. XXXI. S. 51.\n*\nHoppe-Seylers Zeitschrift f. physiol. Chemie. LXXI.\n32\n0","page":477},{"file":"p0478.txt","language":"de","ocr_de":"Druck : l\u00f6 mm\nDampftemperatur:\nAlkoholfraktion :\n13-11\t.\n11 * 11 *\nFraktion I\n\u00bb 11. \u00bb\tIII.\nDie Ausbeute an destillierten Estern war besser, als ich sie sonst bei der Hvdrolvse erhielt. Doch ist diese bessere\nW\t-\tft\nAusbeute auf die Ammoniakmethode zu beziehen.1)\nHestimmt wurde von den \u00fcbrigen Aminos\u00e4uren nur das Phenylalanin zu 0.5 \u00b0/o.\nWenn ich die Resultate noch kurz zusammenfasse, so ergibt sich folgendes:\nEiwei\u00dfk\u00f6rper werden auch in absolut alkoholischer L\u00f6sung unter dem Einflu\u00df von Salzs\u00e4ure gespalten. Die Spaltung ist bei gen\u00fcgender Dauer des Versuches eine vollst\u00e4ndige.\nPartielle Spaltung erfolgt schon nach kurzer Zeit.\nInfolge leichter Verseifbarkeit des Glykokollesters kann diese Aminos\u00e4ure bei unvollst\u00e4ndiger Veresterung, wenn sie in nicht bedeutender Menge vorhanden ist, der Auffindung leicht entgehen.\nIch m\u00f6chte aus all diesem den Schlu\u00df ableiten, da\u00df, wenn man die Estermethode bei Stoffwechselversuchen. wo es sich eventuell um Gemische von Eiwei\u00dfk\u00f6rpern und Aminos\u00e4uren handelt, weiter anwenden will, man dies nur mit \u00e4u\u00dferster Vorsicht tun kann unter fortw\u00e4hrender Kontrolle durch Blindversuche, da sonst die gewonnenen Resultate v\u00f6llig unzuverl\u00e4ssig sein und zu ganz falschen Schl\u00fcssen Anla\u00df geben k\u00f6nnen. 2 )\nDieselben Vorsichtsma\u00dfregeln w\u00e4ren nat\u00fcrlich bei der Anwendung der leichter spaltbaren Polypeptide zum Fermentnachweis zu gebrauchen und es mu\u00df noch entschieden werden, ob diese Vorsichtsma\u00dfregeln gen\u00fcgen, eine Sicherheit der Resultate zu gew\u00e4hrleisten.\n') Pribram, 1. c.\n*1 Man k\u00f6nnte versuchen, die Veresterung unter Eisk\u00fchlung vor sieh gehen zu lassen, wobei allerdings noch die Frage zu entscheiden ist. ob diese dann eine vollst\u00e4ndige ist. Nach Emil Fi sc lier soll der Alkohol bei der Veresterung ins Sieden kommen.","page":478}],"identifier":"lit19258","issued":"1911","language":"de","pages":"472-478","startpages":"472","title":"\u00dcber die Anwendbarkeit der Estermethode bei Stoffwechselversuchen","type":"Journal Article","volume":"71"},"revision":0,"updated":"2022-01-31T14:02:29.826116+00:00"}