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{"created":"2022-01-31T15:44:40.172373+00:00","id":"lit20571","links":{},"metadata":{"alternative":"Zeitschrift f\u00fcr Physiologische Chemie","contributors":[{"name":"Pauly, Herm.","role":"author"}],"detailsRefDisplay":"Zeitschrift f\u00fcr Physiologische Chemie 94: 284-290","fulltext":[{"file":"p0284.txt","language":"de","ocr_de":"Zur Kenntnis der Oiazoreaktion des Eiwei\u00dfes.\n' \u25a0\t' Von\nHerrn. Pauly.\n(Der Redaktion zugegangen am 2(i. Mai 1915.)\nNachdem ich im Jahre 1904 festgestellt hatte, da\u00df das Histidin nicht, wie vordem Fr\u00e4nkel angenommen hatte, sich vom Pyrimidin herleitet, sondern, da\u00df ihm auf Grund seiner Reaktionen und Derivate kein anderes Ringsystem, als das des Imidazols zugrunde liegen k\u00f6nne, habe ich als erster die urspr\u00fcnglich von Wallach am Imidazol gepr\u00fcfte Oiazoreaktion auf das Histidin und im Anschlu\u00df daran auf die \u00fcbrigen Aminos\u00e4uren und die Proteine \u00fcberhaupt angewandt.1) Ich konnte\n*) Diese Zeitschrift, Bd. 42, S. 512 (1904). Da \u00fcber die Geschichte dieser Reaktion vereinzelt eine gewisse Unklarheit zu bestehen scheint, so sei k\u00fcrz an Folgendes erinnert. Die Diazoverbindungen und ihre Kupplungsf\u00e4higkeit mit gewissen aromatischen Verbindungen zu sogenannten Azofarbstoffen wurde im Jahre 1860 von Peter Grie\u00df entdeckt. Das Verhalten heterozyklischer Substanzen gegen\u00fcber Diazol\u00f6sungen ist dagegen nach ihm von anderen Chemikern untersucht worden, so, wie erw\u00e4hnt, das des Imidazols 1886 durch Wallach (und seine Sch\u00fcler Rung nnd Behrend). Sp\u00e4ter hat dann auch Burian Azok\u00f6rper aus Imidazolen und den ihnen nahe verwandten Purinen dargestellt (Ber. d. deutsch, ehern. Ges., Bd. 37, S. 696 (1904)). Auf der andern Seite empfahl schon im Jahre 1882 P. Ehrlich die Farbstoffbildung mit Diazobenzol-sulfos\u00e4ure zur Harnuntersuchung in gewissen pathologischen F\u00e4llen, ohne indes einen Anhalt zu haben, durch welcherlei Art von im Harn anwesenden Stoffen die erstere herbeigef\u00fchrt werde. Dies ist auch heute bekanntlich noch ziemlich unaufgekl\u00e4rt, wenngleich in neuerer Zeit ermittelt worden ist, da\u00df das sogenannte Urochromogen, das als der Tr\u00e4ger der Ehrlichschcn Harnprobe angesehen wird, von oxyproteins\u00e4ure-\u00e4hnlichem Charakter ist. Daher kann es wohl nicht zweifelhaft sein, da\u00df mit klarer Einsicht in ihre chemische Wirkungsweise ich zuerst die Diazo-reaktion auf das Gebiet des Eiwei\u00dfes und seiner Spaltk\u00f6rper \u00fcbertragen habe. Wenn sich also z. B. in dem Biochemischen Handlexikon von Abderhalden (Bd. 4, S. 715) eine Bemerkung findet, wie: \u00abdas Histidin kann durch die Diazoreaktion von Ehrlich und Burian nachgewiesen werden, so ist eine solche schief und berichtigungsbed\u00fcrftig\u00bb.","page":284},{"file":"p0285.txt","language":"de","ocr_de":"Zur Kenntnis der Diazoreaktion des Eiwei\u00dfes.\t-85\nzeigen, da\u00df von allen bekannten Aminos\u00e4uren nur zwei bef\u00e4higt sind, echte Farbstoffe zu bilden, n\u00e4mlich das Histidin und das Tyrosin. Zugleich wies ich auf die chemische Ursache dieser Erscheinung hin, die in dem Vorhandensein eines ein bewegliches Wasserstoffatom tragenden \u00abHeteroatomes* * an den unges\u00e4ttigten Ringsystemen, wie Phenol und Imidazol, zu suchen sei.1) Die \u00dcbertragung der Reaktion auf Proteine ergab dann, da\u00df es m\u00f6glich ist, Tyrosin und Histidin auch nachzuweisen, wenn sie sich noch im festen Verb\u00e4nde befinden, dehn alle, eine der beiden oder beide Aminos\u00e4uren enthaltenden Eiwei\u00dfk\u00f6rper zeigten die Rotf\u00e4rbung deutlich, die \u00fcbrigen f\u00e4rbten sich gleich den anderen Aminos\u00e4uren rein gelb. Eine Unterscheidung zwischen Tyrosin und Histidin erm\u00f6glichte die Hinzuziehung der Reaktion von Millon.1) Somit war in der Diazoreaktion eine neue, durch hohe Empfindlichkeit sich auszeichnende Eiwei\u00dfprobe gefunden, die den bis dahin bekannten sich ebenb\u00fcrtig an die Seite stellen konnte, denn Proteine, die kein Tyrosin oder Histidin enthielten, kennt man, sicher wenigstens, bis heute nur unter den eine Sonderklasse bildenden Protaminen.\nAuf Grund der gemachten Feststellungen ergab sich als weiterer Schlu\u00df, da\u00df die l\u00e4nger schon der Farbentechnik bekannten F\u00e4rbungen, die tierische Wolle und S\u00e9ide mit alkalischen Diazol\u00f6sungen annehmen, in der Hauptsache, auf den\n*) Man sollte erwarten, da\u00df auch bei dem ein derartiges Ringsystem f\u00fchrenden Tryptophan die Diazoprobe positiv ausfiele. Hier liegt aber die Sache so, da\u00df man zwar mit dem Grundringsystem, dem Indol, eine F\u00e4rbung bekommt, dagegen nicht mit den \u00df-substilulerten Derivaten desselben; infolgedessen ist der Ajaninrest auch im Tryptophan der Reaktion hinderlich (Vgl. Pauly und Gundermann, Ber. d. deutsch, ehern. Ges., Bd. 41, S. 4004, Anm. 3 (1909).\n*) \u00df\u00dfi dieser Gelegenheit sei eine kleine, bisweilen vorteilhafte Ab\u00e4nderung der Mi\u00fconschen Reaktion mitgeteilt. Sie besteht darin, da\u00df man die Mischung (nach Nasse bereitet) in wenigen Tropfen vorsichtig \u00fcber konzentrierte Schwefels\u00e4ure schichtet, wie bei der Pr\u00fcfung auf Salpeters\u00e4ure und dann von der fraglichen Substanz zugibt. Nach kurzer Zeit verr\u00e4t sich anwesendes Tyrosin ohne vorheriges Erw\u00e4rmen beim ruhigen Liegen des Reagensglases durch das Auftreten braunvioletter F\u00e4rbungen an der Oberfl\u00e4che der Fl\u00fcssigkeit. \u2022","page":285},{"file":"p0286.txt","language":"de","ocr_de":"286\tHermann Pauly,\n. I ;\ti;':' , \u25a0 V V:;V / ;i ;\t\u2022\u2022 \u2022 . . ;\nhohen Gehalt an Tyrosin in der Faser zur\u00fcckzuf\u00fchren sind.1) (Da\u00df sich die auf der tierischen Faser mit frischbereiteter, sodaalkalischer Diazobenzolfulfos\u00e4ure erzeugten F\u00e4rbungen zu einem recht augenf\u00e4lligen Vorlesungsversuch f\u00fcr den Nachweis des Vorhandenseins von Tyrosin im Eiwei\u00df der Faser eignen, bedarf kaum besonders hervorgehoben zu werden.)\nEine feinere analytische Ausbildung erfuhr die Diazo-reaktion in der Folge durch A. Kossel und seine Mitarbeiter. Er benutzte sie zun\u00e4chst, um sein bekanntes Trennungsverfahren von Histidin und Arginin bequemer zu gestalten.2)\nHir\u00e4yama3) f\u00fchrte dann in das Sturin die Benzol- oder Naphthalinsulfogruppe ein und fand, da\u00df dadurch der von mir an dem genuinen Protamin festgestellte positive Ausfall der Reaktion ausblieb. Da einerseits nur Imidazole mit freier Imidgruppe kuppeln, andererseits Sulfochloride das Wasserstoffatom der Imidgruppe unter Ersatz durch den Sulforest entfernen, so f\u00fchrte dies zu dem Schl\u00fcsse, da\u00df im Sturin die Imidazolkerne frei sind. Das deckte sich mit dem Ergebnis der gleichzeitig von mir vorgenommenen Jodierung des Sturins.\nInouye,1) der sich mit der Unterscheidung von Histidin und Tyrosin befa\u00dfte, stellte die interessante Tatsache fest, da\u00df Histidin im eiwei\u00dfartigen Verb\u00e4nde bei der Benzoylierung nach Schotten-Bau mann zerst\u00f6rt wird, dagegen im freien Zustande nicht. Infolgedessen kann man nach vorausgegangener Benzoylierung mit Hilfe der Diazoreaktion wohl freies Histidin von freiem Tyrosin (das in einnichtreagierendesDibenzoylat\u00fcbergef\u00fchrt wird) unterscheiden, nicht jedoch gebundenes Histidin von gebundenem Tyrosin. Andererseits bietet die Methode einen Weg, fermentativ sich abspaltendes Histidin von noch verkettetem zu unterscheiden und so den Gang der Hydrolyse zu verfolgen.\nDer Grund der Best\u00e4ndigkeit des ersteren ist nach A. Kossel und Edlbacher4) in dem Vorhandensein der freien Garboxylgruppe zu suchen, die auf den Imidazolring eine noch\n*) H. Pauly und A. Binz, Zeitschrift f\u00fcr Farben- und Textilindustrie, 111, H. 20 (1904).\n*) Diese Zeitschrift, Bd. 49, S. 301\u2014321 (1907).\n8) Diese Zeitschrift, Bd. 59, S. 285 (1909). y 4) Diese Zeitschrift, Bd. 83, S. 79 (1913).","page":286},{"file":"p0287.txt","language":"de","ocr_de":"Zur Kenntnis der Diazoreaktion des Eiwei\u00dfes.\t287\nunaufgekl\u00e4rte Schutzwirkung aus\u00fcbt. Ist hingegen das Carboxyl aus irgend einem Grunde unwirksam geworden, sei es auf k\u00fcnstlichem Wege durch Veresterung oder auf nat\u00fcrlichem durch eiwei\u00dfartige Verkettung, so erleidet der Hing die gleiche Aufl\u00f6sung bei der Benzoylierung, wie das Imidazol selbst und die Diazoreaktion bleibt infolgedessen aus, \u2019\nAus alledem erhellt wohl zur Gen\u00fcge deren vielseitige Verwendungsm\u00f6glichkeit bet der qualitativen und quantitativen Untersuchung von Proteinen und ihren Abbauk\u00f6rpern. Es\nschien deswegen w\u00fcnschenswert, zu wissen, wie die aus Tvrosin und Histidin sich bildenden Azofarbstoffe zusammengesetzt sind. Nun h\u00e4tte es zwar nahegelegen, aus den durch* Diazobenzol-sulfos\u00e4ure erh\u00e4ltlichen Farbstoffl\u00f6sungen die zugeh\u00f6rigen Farbstoffe abzuscheiden, allein es erwiesen sich diese als ziemlich leichtl\u00f6slich, soda\u00df ihre Reinigung unbequem war.\nNimmt man aber an Stelle von Diazobenzolsulfos\u00e4ure Diazobenzolarsins\u00e4ure, die man aus dem im Handel befindlichen \u00abAtoxyl\u00bb, dem Natriumsalz der Arsanils\u00e4ure, sich leicht bereiten kann, so zeichnen sich die Azofarbstoffe der beiden Aminos\u00e4uren durch sehr geringe L\u00f6slichkeit in Wasser aus und kommen, soweit Analysen und Aussehen der mikro-krystallinischen Massen diesen Schlu\u00df gestatten, sofort bei der Abscheidung rein heraus.\nAus den erhaltenen Analysen werten folgt, da\u00df sowohl Tyrosin wie auch Histidin mit der Diazoverbindung im Verh\u00e4ltnis von 1:2 zusammentreten, und da beide Aminos\u00e4uren mehrere Angriffspunkte in ihrem Molek\u00fcl besitzen, so fragt es sich, wo die farbst\u00f6ffbildenden Radikale eintreten. Entweder k\u00f6nnen sie sich mit den Amin- und Imingruppen verbinden, dann liegen sogenannte Diazoaminoverbindungen vor, oder sie ersetzen Wasserstoffe der Ringkohlenstoffatome, dann haben wir echte Azofarbstoffe, oder es kann endlich beides statt-finden unter Bildung gemischter Diazoazok\u00f6rper. Ohne n\u00e4here Untersuchung ist diese Frage nat\u00fcrlich nicht definitiv zu entscheiden, doch spricht die Best\u00e4ndigkeit der Farbstoffe beim Kochen mit verd\u00fcnnter Salzs\u00e4ure daf\u00fcr, da\u00df sogenannte Kern-, d. h. C-Bindung erfolgt ist. Es ist n\u00e4mlich gerade in neuerer","page":287},{"file":"p0288.txt","language":"de","ocr_de":"28S\nHermann Pauly,\nZeit auf die au\u00dferordentliche Unbest\u00e4ndigkeit der mit aliphatischen Resten verkn\u00fcpften DiazoaminoVerbindungen hingewiesen worden, *) die schon bei der Ber\u00fchrung mit lauwarmem Wasser unter Entwicklung von gasf\u00f6rmigem Stickstoff zerfallen, mit verd\u00fcnnter Minerals\u00e4ure dies aber schon in der K\u00e4lte tun. Auf den gleichen Umstand habe ich bez\u00fcglich der Verkettung an dem Imidazolimidrest schon fr\u00fcher hinzuweisen Gelegenheit gehabt.*) Vielmehr deutet der kr\u00e4ftige Farbenton und die deutlich amphotere, an saure Aminos\u00e4uren, wie Asparagins\u00e4ure, erinnernde Natur der Farbstoffe ebenfalls auf Kohlenstoff bindung hin. Somit m\u00f6gen den aus Tyrosin und Histidin hervorgegangenen Farbstoffen Formeln, wie\nN : N \u00bb C6H4 \u00bb AsO,H.2 HOOG - CH(NH2). CH*: / ^>OH\nN : N \u2022 C0H4 \u2022 As03H*\nTy rosin-/,/.s-azobenzolarsins\u00e4ure\nund\t. v: \u2022'\nN=G \u2022 N : N * C0H4 \u2022 As03H2\n)nh\nHOOr.yCH(NHg) \u2022 CH* \u2022 C=C - N : N \u2022 C0H4 \u2022 AsO,H* Histidin-/>/.s-azobenzolarsins\u00e4ure\nzukommen. Hinsichtlich ihrer Nuance gleichen sie den entsprechenden, bisher nur in L\u00f6sung erhaltenen Sulfons\u00e4uren, indem (in saurem Bade) der Tyrosinfarbstoff auf Seide einen aurantia\u00e4hnlichen Goldton, derjenige aus Histidin ein stark nach Rot neigendes, mattes Gelb erzeugt. In Alkalien l\u00f6sen sich die Farbstoffe mit br\u00e4unlichroter, bezw. kirschroter Farbe. Die Ausbeuten erreichen kaum 20 Vo der Theorie ; sie scheinen infolge von Nebenreaktionen und Bildung unbest\u00e4ndiger Verbindungen heruntergedr\u00fcckt zu werden, denn sowohl bei der Bildung, wie bei der Abscheidung der Farbstoffe durch S\u00e4uren beobachtet man reichliche Stickstoffentwicklung.\nDie Bereitung der Farbk\u00f6rper geschah ziemlich in der gleichen Weise, indem eine aus 20 Millimolgramm (5,7 g) Atoxyl in 35 ccm WTasser hergestellte L\u00f6sung erst mit 36 ccm\n') Ber. d. deutsch, ehern. Ges., Bd. 36, S. 911 (1903). *) Diese Zeitschrift, Bd. 4L S. 159 (1905).","page":288},{"file":"p0289.txt","language":"de","ocr_de":"Zur Kenntnis der Diazoreaklion des Eiwei\u00dfes.\t289\nn-Salzs\u00e4ure (Ausscheidung freier S\u00e4ure) und dann tropfenweise mit 90 ccm n/5-Natriumnitritl\u00f6sung versetzt, und die so nach einhalbst\u00fcndiger Einwirkung entstandene Diazomischung zu der alkalischen L\u00f6sung von 10 Miilimolgramm der betreffenden Aminos\u00e4ure gegeben wurde. Letztere war im Falle, des Tyrosins bereitet aus 1,8 g desselben, 10 ccm n-Natronlauge und 20 ccm ges\u00e4ttigter Natriumacetatl\u00f6sung, im Falle des Histidins aus 2 g Chlorhydrat, 35 ccm ges\u00e4ttigter Soda- und 20 ccm ges\u00e4ttigter Natriumacetatl\u00f6sung. Nach etwa 2 Stunden wurden die entstandenen Farbstoffl\u00f6sungen in verd\u00fcnnte Salzs\u00e4ure einlaufen gelassen, wodurch sich die Farbstoffe abschied\u00e8n. Es darf hierbei die Konzentration der S\u00e4ure, namentlich zu Anfang, nicht zu gro\u00df sein; auch mu\u00df ihre Menge eine begrenzte sein, weil die Farbstoffe infolge ihres amphoteren Charakters sich sonst wieder l\u00f6sen. Es kamen zur Verwendung im Falle des Tyrosins 45 ccm n-Salzs\u00e4ure, im Falle des Histidins 25 ccm 5. n-Salzs\u00e4ure, von denen ein kleiner Teil zu Anfang etwas st\u00e4rker verd\u00fcnnt benutzt wurde, weil sonst der Farbstoff sich leicht harzig abscheidet. Nach dem Absaugen wurden beide Farbstoffe gut mit Wasser und schlie\u00dflich mit Alkohol und \u00c4ther ausgewaschen. Sie kamen dann nach mehrt\u00e4gigem Verweilen im Vakuum \u00fcber Schwefels\u00e4ure zur Analyse. Erhalten wurden jeweils 1,2\u20141,5 g. Die Substanzen war\u00e9n chlor- und natriumfrei.\nTyros in-bis-azobenzulars ins aurez*\n0,1120 g gaben 0,0512 g Mg,Asa07 ;\n0,1826 g gaben 0,0846 g MgtAstO, ;\n0,2028 g gaben 0,0928 g Mg,Ast\u00d67 ;\n0,1767 g gaben 0,2391 g CO, und 0,0584 g H,0 ; \u2022\n0,4106 g verloren bei 103\u00ae 0,0216 g Hg0.\nBerechnet f\u00fcr C0H#O,N (N : N \u2022 C6H4 \u2022 AsOsH,), -f 2 H,0 :\nAs 22,3 \u00b0/\u00b0\u00bb C 37,4 \u2022/\u2022, H 3,7 \u00b0/o, H,0 5,3 \u00bbjo. Gefunden: As 22,1\u00ae/\u00ab, 22,4 \u00ab/o, 22,0\u00ab/o; C 36,9\u00b0/\u00ab; H 3,7 \u00b0/o; H,0 5,3 \u00b0/o.\nHistidin-bis-azobenzolarsins\u00e4ure.\n0,1974 g gaben 0,1014 g Mg,As,07;\n0,2589 g gaben 0,3428 g GO, und 0,0825 g H,0.\nBerechnet f\u00fcr C\u201eH.02Ns(N : N \u2022 C\u00d6H4 \u2022 As03Ht), :\nAs 24,5\u00b0/\u00ab, C 35,4 \u00b0/o, H 3,1 \u00b0/*.\nGefunden; As 24,8\u00b0>, C 36,0*/#, H 3,5","page":289},{"file":"p0290.txt","language":"de","ocr_de":"290 Hermann Pauly, Zur Kenntnis der Diazoreaktion des Eiwei\u00dfes.\nBeide Farbstoffe bilden hellbraune in Wasser sehr wenig, in organischen indifferenten L\u00f6sungsmitteln nicht l\u00f6sliche mikro-krystallinische Pulver. Sie sind in mehr als 6fach normaler Salzs\u00e4ure mit gelbbrauner Farbe klar l\u00f6slich, mit Alkalien bilden sie kr\u00e4ftig rotgef\u00e4rbte L\u00f6sungen. Beim Kochen mit st\u00e4rkerer S\u00e4ure entwickeln sie keine nennenswerte Menge Stickstoff und ver\u00e4ndern auch den Farbenton nicht.\nBei diesen Versuchen bin ich von Herrn Karl Lockemann in dankenswerter Weise unterst\u00fctzt worden.\nW\u00fcrzburg, im Mai 1915.","page":290}],"identifier":"lit20571","issued":"1915","language":"de","pages":"284-290","startpages":"284","title":"Zur Kenntnis der Diazoreaktion des Eiwei\u00dfes","type":"Journal Article","volume":"94"},"revision":0,"updated":"2022-01-31T15:44:40.172378+00:00"}