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{"created":"2022-01-31T15:27:21.775777+00:00","id":"lit20721","links":{},"metadata":{"alternative":"Zeitschrift f\u00fcr Physiologische Chemie","contributors":[{"name":"Feulgen, R.","role":"author"}],"detailsRefDisplay":"Zeitschrift f\u00fcr Physiologische Chemie 102: 244-251","fulltext":[{"file":"p0244.txt","language":"de","ocr_de":"Bestimmung der Purinbasen in Nucleine\u00e4uren nach huminfreier\nSpaltung.\nVon\nR. Feulgen.\n* (Aus dem physiologischen Institute der Universit\u00e4t Berlin.)\n(Der Redaktion zugegangen am 1. Mai 1918.)\nEin quantitativer oder auch nur qualitativer Nachweis der Purinbasen in Nucleins\u00e4uren ist nur m\u00f6glich durch Isolierung der Basen bezw. geeigneter Verbindungen derselben nach voraufgegangener Aufspaltung. Einer Reindarstellung der Basen stehen aber besonders bei den Nucleins\u00e4uren vom Typus der Thymonucleins\u00e4ure gro\u00dfe Schwierigkeiten entgegen, zumal wenn nur geringe Mengen Nucleins\u00e4ure zur Verf\u00fcgung stehen.\nEs bilden sich n\u00e4mlich bei der Hydrolyse dieser Nucleins\u00e4uren, die zu 50\u00b0/o aus \u00e4u\u00dferst leicht verharzendem Kohlenhydrat bestehen, stets gro\u00dfe Mengen Huminstoffe, die die Hydrolysenfl\u00fcssigkeit braun-schwarz f\u00e4rben. Da nun von allen stickstoffhaltigen Bestandteilen der Nucleins\u00e4ure im Laufe der Aufarbeitung immer zuerst die Purinbasen durch F\u00e4llung abgschieden werden, so haften gerade diesen Niederschl\u00e4gen gro\u00dfe Mengen adsorbierter melanin\u00e4hnlicher Stoffe an, zumal da die beiden Purinbasen nur zu je 10\u00b0/o in der Nucleins\u00e4ure Vorkommen, also gegen\u00fcber dem verharzenden Kohlenhydrat und gegen\u00fcber der Gesamtmenge der gespaltenen Nucleins\u00e4ure nur in geringer Menge vorhanden sind. Die Entf\u00e4rbung der braun-schwarzen Rohprodukte ist eine sehr unerfreuliche Aufgabe; nachtr\u00e4gliche Anwendung von oxydierenden oder reduzierenden Mitteln ist ohne Erfolg, und bei Verwendung von Tierkohle treten wegen der Notwendigkeit ver\u00e4ltnism\u00e4\u00dfig gro\u00dfer Mengen Kohle und wegen ihrer stark adsorbierdenden Wirkung","page":244},{"file":"p0245.txt","language":"de","ocr_de":"Bestimmung der Purinbasen in Nucleins\u00e4uren usw. 245\nauch auf die Basen in schwefelsaurer L\u00f6sung gro\u00dfe Verluste auf, soda\u00df eine Orientierung \u00fcber die wirklich vorhandene Menge sehr erschwert ist.\nDazu kommt die Schwierigkeit der Trennung des Guanins vom Adenin. Sie wird wohl meist mit der Ammoniakmethode ausgef\u00fchrt, indem verd\u00fcnntes Ammoniak zwar Adenin l\u00f6st, Guanin aber ungel\u00f6st lassen soll. Aber gerade bei den Spaltprodukten der Nucleins\u00e4ure versagt diese Methode h\u00e4ufig, weil leider meist das Guanin kolloidal in L\u00f6sung geht, ein Umstand, der zu gro\u00dfen Irrt\u00fcmern Veranlassung geben kann, wenn dem Beobachter, der Methode blind trauend, wegen der. starken F\u00e4rbung das Vorhandensein einer kolloidalen Tr\u00fcbung entgeht. H. Steudel \u00e4u\u00dfert sich \u00fcber die Trennung von Guanin und Adenin folgenderma\u00dfen:1) \u00abDie in ihren F\u00e4llungsverh\u00e4ltnissen fast gleichen Basen Guanin und Adenin lassen sich absolut rein nur mit relativ gro\u00dfen Verlusten voneinander trennen\u00bb. Nat\u00fcrlich werden auch hier die Schwierigkeiten noch gr\u00f6\u00dfer, wenn nur geringe Mengen besonders wertvollen Materials ausgespalten werden k\u00f6nnen.\nSehr vereinfacht und erleichtert wurde die quantitative Purinbasenbestimmung durch die Abspaltung der Purine mittels starker Salpeters\u00e4ure nach H. Steudel. Diese Methode liefert bei vorsichtiger Durchf\u00fchrung ohne wesentliche Hurain-bildung direkt ein Gemenge der schwerl\u00f6slichen Nitrate der Basen, die dann aber mit der Ammoniakmethode noch getrennt werden m\u00fcssen. Da man aber die Salpeters\u00e4urespalfung wegen der Gefahr der Desamidierung der Purine nicht bis zur vollst\u00e4ndigen Aufspaltung des ganzen Nucleins\u00e4uremolek\u00fcls ausdehnen kann, zumal eine Temperaturerh\u00f6hung aus demselben Grunde ausgeschlossen ist, so verbietet sich diese Methode von selbst bei Nucleins\u00e4uren, deren Purine nicht, wie bei der Thymonucleins\u00e4ure, \u00e4u\u00dferst leicht abspaltbar sind. Ist die leichte Abspaltbarkeit z. B. bei einer unbekannten Nucleins\u00e4ure nicht sicher, so wird man vorziehen, die Hydrolyse nach einer indifferenten Methode bis zur vollkommenen Abspaltung aller\nPhosphors\u00e4ure fortzusetzen.\n\u2014\n\u25a01 Abderhalden, Handbuch der biochemischen Arbeitsmethoden.","page":245},{"file":"p0246.txt","language":"de","ocr_de":"240\tR. Feulgen.\nIn Anbetracht all dieser Schwierigkeiten schien mir eine Methode von Vorteil, die\n1.\teine vollst\u00e4ndige Aufspaltung ohne die geringste Hiiminbildung gestattet,\n2.\teine automatische vollkommene Trennung des Guanins und Adenins erfolgen l\u00e4\u00dft,\n3.\tAusbeuten an reinem Guanin von ca. 95 \u00b0/o, an Adenin von ungef\u00e4hr 80\u201485 \u00b0/o gew\u00e4hrleistet. (Die geringere Ausbeute an Adenin ist die Folge des immer notwendigen \u00f6fteren F\u2019\u00e4llens bei der Isolierung.)\nEs ergab sich n\u00e4mlich, da\u00df in Gegenwart von schweflig-sauren Salzen eine vollkommen huminfreie Spaltung zu erzielen war, und zwar sowohl in schwach alkalischer als auch in neutraler und saurer Reaktion. Die Wirkung der Sulfite bei der Farbloshaltung ist wohl eine oxydierende, da auftretender Schwefel eine Reduktion der Sulfite anzeigte. Da die Sulfite aber bereits aufgetretene Huminstoffe nicht wesentlich zu entf\u00e4rben verm\u00f6gen, so ist ihr Zusatz zur Nucleins\u00e4ure so zu bemessen, da\u00df \u00fcberhaupt F\u00e4rbungen vermieden werden. Freie schweflige S\u00e4ure ist nicht brauchbar, hier ist offenbar die verharzende S\u00e4urewirkung zu gro\u00df. Zur quantitativen Isolierung der Purinbasen haben sich aber nur die sauren schwefligsauren Salze (k\u00e4ufliche L\u00f6sung von Natriumbis\u00fclfit) als geeignet erwiesen.\nMan erh\u00e4lt hiermit leicht eine vollkommen wasserhelle Hydrolysenfl\u00fcssigkeit, aus der sich das Guanin schon w\u00e4hrend des Erhitzens im Drucktopfe geradezu quantitativ als farblose, derbe, grobflockige Masse abscheidet. Das so gewonnene Guanin l\u00e4\u00dft sich leicht filtrieren im Gegens\u00e4tze zu den nach den bisherigen Methoden erzielten gelartigen Niederschl\u00e4gen, bei denen man ohne Zentrifuge kaum auskommt. Eine Neigung, kolloidal in L\u00f6sung zu gehen, besteht nicht. Das Adenin bleibt in der sauer reagierenden Fl\u00fcssigkeit in L\u00f6sung. Es besteht keine Gefahr, da\u00df das Guanin etwa Adenin einschlie\u00dfen k\u00f6nnte; denn das Guanin scheidet sich schon bei hoher Temperatur im Drucktopfe aus, also unter einer Bedingung, unter der das Adenin unter allen Umst\u00e4nden noch leicht l\u00f6slich ist.","page":246},{"file":"p0247.txt","language":"de","ocr_de":"Bestimmung der Purinbasen in Nucleins\u00e4uren usw. \u00a347\nDie Trennung von Guanin und Adenin ist also nicht nur eine automatische, sondern auch eine vollkommene. Auch Thymin l\u00e4\u00dft sich aus der Hydrolysenfl\u00fcssigkeit gewinnen, jedoch kein Cytosin. Wahrscheinlich ist es zu Uracil oxydiert worden. Wegen Materialknappheit wurde das Verbleiben des Cytosins nicht weiter verfolgt, ebensowenig wie das Schicksal des Kohlenhydrates. Da aber bei der Aufarbeitung der Basen nach der \u00fcblichen Schwefels\u00e4urespaltung die Hauptmenge der Huminstoffe bereits mit den Purinniederschl\u00e4gen entfernt werden, so macht die Darstellung des Thymins und Cytosins nach der alten Methode weniger Schwierigkeiten als die Entf\u00e4rbung des Guanins und Adenins, zumal, wenn man dabei die Purinbasenfraktion, weil mit Huminstoflen \u00fcberladen, einfach verwirft.\nLiegt eine unbekannte Nucleins\u00e4ure vor, so mu\u00df man erst die Dauer der Hydrolyse bei einer bestimmten Temperatur erproben: Es soll einerseits eine farblose Hydrolysenfl\u00fcssigkeit entstehen, anderseits aber soll auch alle Phosphors\u00e4ure abgespalten sein. Eine \u00fcberm\u00e4\u00dfig lange Dauer des Prozesses ist hinwiederum zu vermeiden, da bei jeder Hydrolyse \u2014 auch der mit verd\u00fcnnter Schwefels\u00e4ure \u2014 wenn \u00fcberm\u00e4\u00dfig angewandt, eine teilweise Desamidierung oder gar vollst\u00e4ndige Zerst\u00f6rung der Purink\u00f6rper platzgreifen kann.\nZur Vorprobe werden 0,5 g nucleinsaures Natrium in einem R\u00f6hrchen mit 5 ccm der verd\u00fcnnten Sul\u00dftl\u00f6sung gel\u00f6st, und das Rohr nach dem Zuschmelzen 5 Stunden auf 160\u00b0 erhitzt. Nach dem Abk\u00fchlen macht man unter gleichzeitiger Verd\u00fcnnung mit Ammoniak stark alkalisch, f\u00e4llt mit Magnesiamischung die anorganische Phosphors\u00e4ure aus und filtriert in einen Veraschungskolben von 3/i Liter Inhalt hinein. Das Filtrat wird nun bis fast zur Trockne eingedampft, und sodann die Veraschung nach der Neumannschen Methode vorgenommen. Notwendig sind etwa 30 ccm des Neumannschen S\u00e4uregemisches. Nach der Veraschung verd\u00fcnnt man mit 150 ccm Wasser, versetzt mit 50 ccm 500/oiger\"Ammoniumnitratl\u00f6sung, erhitzt zum Sieden und f\u00fcgt endlich zu der hei\u00dfen Fl\u00fcssigkeit 20ccm 10\u00b0/oiger Ammoniummolybdatl\u00f6sung hinzu:","page":247},{"file":"p0248.txt","language":"de","ocr_de":"R. Feulgen,\nEs darf weder ein gelber Niederschlag noch eine nennenswerte gelbe F\u00e4rbung auftreten.\nBei der von mir benutzten Sulfitl\u00f6sung war ein Verh\u00e4ltnis von 15 ccm Sulfitl\u00f6sung auf 35 ccm Wasser passend ; in dieser Mischung wurde dann das nucleinsaure Natrium zu etwa 10\u00b0/o gel\u00f6st. Am besten findet die Spaltung in einem K\u00f6lbchen aus Jenenser Glas nach dem Zuschmelzen statt. Erhitzt wurde 5 Stunden lang, wobei das Thermometer in der Thermometerh\u00fclse des Drucktopfes unkorrigiert 160\u00b0 zeigte. H\u00f6here Temperaturen sind zu vermeiden.\nZur Purinbasenbestimmung gen\u00fcgen wenige Gramm Substanz; 5 g sind unter allen Umst\u00e4nden ausreichend, aber es werden auch mit einem einzigen Gramm gute Resultate erzielt.\nAusf\u00fchrung der Bestimmung.\n5,000 g nucleinsaures Natrium (von lufttrocknem entsprechend mehr) werden in 35 ccm Wasser gel\u00f6st, 15- ccm k\u00e4ufliche Sulfitl\u00f6sung zugesetzt, und die Fl\u00fcssigkeit, in einem Einschlu\u00dfk\u00f6lbchen eingeschmolzen, 5 Stunden auf 160\u00b0 erhitzt. Alsdann l\u00e4\u00dft man zur restlosen Abscheidung des Guanins mehrere Stunden bei Zimmertemperatur stehen.\nGuanin.\nMan entleert den Inhalt des Einschiu\u00dfgef\u00e4\u00dfes in ein Becherglas, wobei durch Einf\u00fcllen von etwas Wasser und Erw\u00e4rmen \u00fcber der Flamme auch alles an der Glaswand etwa fest sitzende Guanin gelockert wird, und filtriert unter anf\u00e4nglichem vorsichtigen Abgie\u00dfen durch ein mit verd\u00fcnnter Sulfitlauge (15 : 35) und Wasser ausgewaschenes und sodann bei 100\u00b0 konstant gemachtes Filter. Der R\u00fcckstand wird wiederholt mit Wasser ausgekocht und dann ebenfalls auf das F\u00fcter gebracht. Die Menge des Filtrates soll ungef\u00e4hr 150 ccm betragen. Das Filter samt dem Guanin wird bei 100\u00b0 getrocknet und gewogen. Ausbeute: 0,510 g = 10,2 \u00b0/o des nucleinsauren Natriums (ber. 10,87 \u00b0/o).\nEs entsteht hier zun\u00e4chst die Frage, ob das gewogene Guanin als gen\u00fcgend rein angesehen werden kann. Dies ist","page":248},{"file":"p0249.txt","language":"de","ocr_de":"Bestimmung der Purinbasen in Nucleins\u00e4uren usw. 249\nt\n\u2022 * \\\nzu bejahen, da durch einfaches L\u00f6sen in verd\u00fcnnter Schwefels\u00e4ure nach dem Erkalten sich reines krystallisiertes Guaninsulfat mit einer Ausbeute von 90\u00b0/<> der Theorie aus dem amorphen Guanin gewinnen l\u00e4\u00dft, wobei die in der Mutterlauge verbleibende Menge nicht einmal ber\u00fccksichtigt worden ist.\nZu diesem Zwecke und zur Identifizierung des Guanins wird dieses in der 20fachen Menge 10\u00b0/oiger Schwefels\u00e4ure in Siedehitze gel\u00f6st. Nach dem Abk\u00fchlen scheidet sich das mit 2 Molek\u00fclen Krystallwasser krystallisierende Salz in sch\u00f6nen Nadeln ab. Die Krystalle werden abgesaugt und mit Alkohol nachgewaschen.\nAusbeute an Guaninsulfat: 0,654 g.\nDas Salz wurde als Guaninsulfat erkannt:\n1.\tAn dem \u00e4u\u00dferen Verhalten der Krystalle: Mit Krystallwasser sehr lockeres Filzwerk, das aber nach dem Trocknen bei 140\u00b0 unter Verlust des Krystallwassers diese Eigenschaft verliert und in ein grobes Krystallpulver \u00fcbergeht.\n2.\tDurch Ermittlung des Krystallwassergehaltes.\n3.\tDurch Ermittlung des Stickstoffgehaltes.\n4.\tAn der Eigent\u00fcmlichkeit des Guaninsulfates, mit Wasser unter Zerfall des Salzes durch hydrolytische Dissoziation freies unl\u00f6sliches Guanin ausfallen zu lassen.\n0,1112 g exsikkatortrocken verloren bei 140\u00b0 0,0090 g Wasser\n0,1072 g wasserfrei entsprachen 26,7 ccm n/to-S\u00e4ure (Kjeldahl)\n0,0980 g *\t\u00bb\t24,5 ccm \u00bb\t*\nBerechnet f\u00fcr (QH^O^H^SO\u00ab :\tGefunden :\nN 35,00 */o.\t34,90\u00b0/o; 35,06\u00bb/o.\nAdenin.\nDas Filtrat vom Guanin wird mit 10 ccm konzentrierter Schwefels\u00e4ure, die erst mit dem gleichen Volumen Wasser verd\u00fcnnt wird, versetzt und ohne R\u00fccksicht auf den sich milchig abscheidenden Schwefel mit 10 g Phosphorwolframs\u00e4ure in 50 ccm Wasser gel\u00f6st, vollst\u00e4ndig ausgef\u00e4llt. Nach halbst\u00fcndigem Stehen saugt man den Niederschlag durch ein Filter, das zuvor durch Ansaugen einer Talkumaufschwemmung gedichtet worden war, und w\u00e4scht den R\u00fcckstand mit 100 ccm\nHoppe-Seyler\u2019s Zeitschrift f. physiol. Chemie. CII.\t18","page":249},{"file":"p0250.txt","language":"de","ocr_de":"250\tR. Feulgen,\n10\u00b0/oiger Schwefels\u00e4ure, die 1 g Phosphorwolframs\u00e4ure enth\u00e4lt, gut aus. Man verreibt jetzt den Filterr\u00fcckstand mit Wasser, bringt die Aufschwemmung in einen Kolben, erw\u00e4rmt auf dem Wasserbade, versetzt mit ein paar Tropfen Phenolphthaleinl\u00f6sung und zersetzt den Niederschlag mit hei\u00df ges\u00e4ttigter Barytl\u00f6sung, bis bleibende Botf\u00e4rbung das Ende des Prozesses in bequemer Weise anzeigt. Den Niederschlag von phosphorwolframsaurem und schwefelsaurem Baryum saugt man ab und w\u00e4scht ihn gut mit hei\u00dfem Wasser aus. Aus dem Filtrat entfernt man sodann das Baryumhydroxyd durch Ans\u00e4uern mit verd\u00fcnnter Schwefels\u00e4ure bis etwas \u00fcber die v\u00f6llige Entf\u00e4rbung hinaus und saugt das Baryumsulfat durch ein Talkumfilter ab. Das Filtrat wird jetzt durch Kochen in einem Kolben auf etwa 100 ccm eingedampft. Man berichtigt nunmehr die Acidit\u00e4t der Fl\u00fcssigkeit, indem man erst mit Natronlauge bis eben zur Rotf\u00e4rbung neutralisiert und sodann mit 5 ccm 10\u00b0/oiger Schwefels\u00e4ure aus\u00e4uert, und gie\u00dft endlich die noch hei\u00dfe L\u00f6sung in ein K\u00f6lbchen, in dem sich 1,5 g fein pulverisiertes Silbersulfat mit etwas Wasser zu einem Brei angefeuchtet befinden. Es entsteht sofort ein dichter Niederschlag von Silbersulfat-Adenin.* Die F\u00e4llung, die durch Umsch\u00fctteln bef\u00f6rdert wird, ist beendet, wenn der Niederschlag sich sehr schnell absetzt, und die dar\u00fcberstehende Fl\u00fcssigkeit klar ist. Etwas kalt ges\u00e4ttigte Silbersulfatl\u00f6sung, in die klare \u00fcberstehende Fl\u00fcssigkeit hineingegossen, darf keinen Niederschlag mehr hervorrufen.\nNach Abk\u00fchlen unter der Wasserleitung und halbst\u00fcndigem Stehen in Eis wird abgesaugt, und der Niederschlag mit etwas kalt ges\u00e4ttigter Silbersulfatl\u00f6sung ausgewaschen. Die Filtration verl\u00e4uft sehr schnell. Jetzt bringt man den Niederschlag in einen Kolben und kocht ihn wiederholt mit im ganzen 100 ccm n-Salzs\u00e4ure und dann noch \u00f6fter mit Wasser aus, wobei die L\u00f6sung jedesmal von dem sich schnell zu Boden setzenden Chlorsilber abgegossen wird. Beim Abk\u00fchlen der salzsauren Adeninl\u00f6sung pflegt sich stets etwas Chlorsilber in sehr fein verteilter Form abzuscheiden. Einmaliges Durchsaugen durch ein Talkumfilter beseitigt schnell","page":250},{"file":"p0251.txt","language":"de","ocr_de":"Bestimmung der Purinbasen in Nucleins\u00e4uren usw. 251\n.\t\u2022\t\u2022\t,\t.\t\u2022\t\u2018i\ndie kolloidale Tr\u00fcbung. Die saure L\u00f6sung wird nun nach Zusatz von etwas Phenolphthaleinl\u00f6sung mit Natronlauge fast ganz neutralisiert, auf 100 ccm eingekocht, mit Natronlauge bis zur eben bestehen bleibenden Rotf\u00e4rbung versetzt, und die Fl\u00fcssigkeit nunmehr hei\u00df in ein Becherglas hineingegossen, in dem sich 2 g Pikrins\u00e4ure befinden. Diese geht sofort in L\u00f6sung, w\u00e4hrend sich sogleich das Adeninpikrat abscheidet. Nach v\u00f6lligem Erkalten saugt man ab, trocknet bei 100\u00b0, entfernt die \u00fcbersch\u00fcssige Pikrins\u00e4ure durch Verreiben und Ausziehen mit Benzol, trocknet und wiegt.\nAusbeute an Adeninpikrat: 1,014 g =*= 0,376 g Adenin = 7,51 \u00b0/o des nucl. Natriums (berechnet : 9,71\u00b0/o).\nAuch das zur W\u00e4gung kommende Adeninpikrat besitzt bereits einen gen\u00fcgenden Grad von Reinheit, weil es in einer Ausbeute von 85\u201487\u00b0/o der Theorie durch einmaliges Um-krystal\u00fcsieren in v\u00f6llig reinen Zustand \u00fcbergef\u00fchrt werden kann. Weitere 10\u00b0/o bleiben in der Mutterlauge; denn zum Umkrystallisieren von 1 g Adeninpikrat sind 350 ccm Wasser erforderlich, in denen 0,1 g gel\u00f6st bleiben (L\u00f6slichkeit des Adeninpikrates 1: 3500 bei 20\u00b0).\nDas reine Adeninpikrat zeigt ein charakteristisches Verhalten : Beim Abk\u00fchlen der hei\u00dfges\u00e4ttigten L\u00f6sung scheidet es sich in sch\u00f6nen gl\u00e4nzenden, d\u00fcnnen, besenartig angeordneten Krystallen aus. Die Krystalle bilden ein lockeres Filzwerk und durchziehen breiartig die ganze Fl\u00fcssigkeit. - Es sieht so aus, als ob gelbe Watte darin flottiere. Beim Absaugen ver* filzen die Krystalle vollkommen und bilden auf dem Filter eine feste gewebe\u00e4hnliche Platte.\nr\nAusbeute an reinem krystallisierten Adeninpikrat: 0,878 g.\nAbgesehen von diesen charakteristischen Eigenschaften wurde das Adeninpikrat am Stickstoffgehalte erkannt.\n%\n0,2522 g lieferten 65,6 ccm Stickstoff; p = 762, t = 15,0 (Dumas).\nBerechnet f\u00fcr (C6H5N5)(CcH,N,07):\tGefunden:\nN 30,78#/o.\t30,60\u00b0/..\nDie Untersuchungen wurden mit Mitteln aus der \u00abGr\u00e4fin Bose-Stiftung\u00bb ausgef\u00fchrt.\n18*","page":251}],"identifier":"lit20721","issued":"1918","language":"de","pages":"244-251","startpages":"244","title":"Bestimmung der Purinbasen in Nucleins\u00e4uren nach huminfreier Spaltung","type":"Journal Article","volume":"102"},"revision":0,"updated":"2022-01-31T15:27:21.775782+00:00"}