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{"created":"2022-01-31T14:35:23.043393+00:00","id":"lit20742","links":{},"metadata":{"alternative":"Zeitschrift f\u00fcr Physiologische Chemie","contributors":[{"name":"Philippi, Ernst","role":"author"}],"detailsRefDisplay":"Zeitschrift f\u00fcr Physiologische Chemie 104: 88-94","fulltext":[{"file":"p0088.txt","language":"de","ocr_de":"Zur Kenntnis der H\u00e4mocyanine.\nVon\nErnst Philippi\nPrivatdozent am II. Chemischen Institut der Universit\u00e4t in Wien.\n(Aus deni II. Chemischen Institut der Universit\u00e4t Wien.)\n(Der Redaktion zuge^angen am 31. Oktober 1918.)\nIm Jahre 1914 habe ich eine kurze vorl\u00e4ufige Mitteilung ver\u00f6ffentlicht1), des Inhaltes, da\u00df es mir gelungen sei, aus dem Blute von Helix pomatia eine Substanz zu gewinnen, die sehr viel Kupfer enthielt und zugleich intensive Pyrrolreaktion zeigte, und daran die Vermutung gekn\u00fcpft, da\u00df es sich um eine dem H\u00e4matin analoge Verbindung handle. Seither sind mehr als 4 Jahre verflossen, ohne da\u00df es mir infolge des Krieges m\u00f6glich gewesen w\u00e4re, meine Untersuchungen fortzusetzen, und da mir dies voraussichtlich in der n\u00e4chsten Zeit ebensowenig m\u00f6glich sein wird, so sehe ich mich veranla\u00dft, nunmehr meine diesbez\u00fcglichen Untersuchungen mitzuteilen, obwohl icli mir bewu\u00dft bin, da\u00df es sich nur um Vorversuche handelt, die noch in jeder Hinsicht des Ausbaues bed\u00fcrfen.\nDer Name H\u00e4mocyanin ist zum erstenmal von Fr\u00e9d \u00e9 r i c q2 ) im Jahre 1878 gebraucht worden, der das Blut von Oktopus vulgaris untersuchte und feststellte, da\u00df es Kupfer enthielt. Das arterielle Blut vieler A Vertebraten ist bekanntlich blau, das ven\u00f6se nahezu farblos; es lag also der Analogieschlu\u00df nahe, im Blute dieser Tiere analog dem H\u00e4moglobin und Oxyh\u00e4moglobin im ven\u00f6sen und arteriellen Blute ein H\u00e4mocyanin (farblos) und ein Oxyh\u00e4mocyanin (blau) anzunehmen. Fr\u00e9d\u00e9rieq gibt nun auch bereits ohne experimentelle Begr\u00fcndung an,\nJ) Philippi, Chemisches Zentralblatt 1914. II, 1165.\n2) Arch, de Zoolog, exper. 7, 535 (1878).","page":88},{"file":"p0089.txt","language":"de","ocr_de":"Zur Kenntnis der H\u00e4mocyanine.\n89\n\u00abla\u00df sich das H\u00e4mocyanin ganz analog dem H\u00e4moglobin durch S\u00e4uren in zwei Komponenten spalten l\u00e4\u00dft, n\u00e4mlich in einen kupferhaltigen Farbstoff und in einen dem Globin \u00e4hnlichen Eiwei\u00dfk\u00f6rper. Seither ist dieser interessante Stoff von mehreren Forschern untersucht worden, ich m\u00f6chte hier nur Phisalix1), Cu\u00e9not2), Griffith3), Henze4) und Dh\u00e9r\u00e96) nennen, und es wurden die widersprechendsten Behauptungen \u00fcber den Kupfergehalt, sowie die Struktur desselben aufgestellt. Der erste Forscher, der ein kristallisiertes und einwandfrei definiertesOxyh\u00e4mo-cyanin in H\u00e4nden hatte, war Henze, der 1901 in der zoologischen Station in Neapel eine Arbeit \u00fcber das Blut von Oktopus vulgaris ausf\u00fchrte. Es gelang ihm mit Hilfe der Hopkins-schen Methode (Amnionsulfat und Essigs\u00e4ure) dieses Oxyh\u00e4mo-cyanin zur Kristallisation zu bringen und er stellte einwandfrei den Kupfergehalt desselben, sowie die dem H\u00e4moglobin \u00e4hnliche elementare Zusammensetzung fest. Anbei die von Abderhalden f\u00fcr Oxyh\u00e4moglobin aus Pferdeblut und von Henze f\u00fcr Oxyh\u00e4mocyanin aus Oktopus vulgaris angegebenen Werte:\nC\tII\tN\tS\tFe\t0\tP\nOxyh\u00e4moglobin:\t51,75\t6,98\t17,35\t0,42\t0,38\t20.12\t\u2014\nCu\nOxyh\u00e4mocyanin\t53.66\t7,33\t16,09\t0,86\t0,38\t21,67\t\u2014\nFerner ermittelte Henze, da\u00df dem H\u00e4mocyanin ebenso wie dem H\u00e4moglobin, auf Grund seiner F\u00e4higkeit, Sauerstoff lose zu binden, respiratorische Eigenschaften zukommen m\u00fc\u00dften. I )ie Sauerstoffkapazit\u00e4t des H\u00e4mocyanins ist jedoch viel geringer.\nEine von Henze ausgef\u00fchrte S\u00e4urehydrolyse des H\u00e4mocyanins lieferte analoge Spaltungsprodukte, wie sie A b d e r h a 1 d e n beim H\u00e4moglobin gefunden hatte, n\u00e4mlich Tyrosin, Leucin,\n\u2019) Phisalix, Compt. rend. de la Soc. de Biol. 52, 729 (1900);\n-I Cu\u00e9not, Compt. rend, de l\u2019academie de sc. 115, 127 (1892).\n*) Griffith, Compt. rend, de l\u2019academie de sc. 114, 496 (1892). 4) Henze, Zeitschrift f\u00fcr physiol. Chemie 33, 370 (1901).\n3) D lit* r\u00e9, Compt. rend, de l\u2019academie de sc. 146, 784 (1908). Dh\u00e9r\u00e9 Compt. rend, de la Soc. de Biol. 55, 1012\u20141162 (1903): 60, 788 (1908). Dh\u00e9r\u00e9, Compt. rend, de l\u2019academie de sc. 158, 978 (1914).","page":89},{"file":"p0090.txt","language":"de","ocr_de":"90\nErnst Philippi,\nHistidin, Lysin und wahrscheinlich auch Glutamins\u00e4ure. Au\u00dferdem gibt Henze an, da\u00df die Bindung des Kupfers viel lockerer sei, als die des Eisens im H\u00e4moglobin; eine kupferhaltige Farbstoffkomponente konnte er niemals auffinden. Er kommt also zu dem Schl\u00fcsse, da\u00df im H\u00e4mocyanin kein h\u00e4matinartiger Komplex vorliege, sondern da\u00df dasselbe als Kupferalbuminat aufzufassen sei.\nSeither ist das H\u00e4mocyanin \u2014 wohl infolge seiner schweren Zug\u00e4nglichkeit \u2014 in chemischer Hinsicht kaum mehr untersucht worden. Keineswegs unerw\u00e4hnt k\u00f6nnen aber die Arbeiten Dh\u00e9r\u00e9s bleiben, der sich mehr mit der physikalischen Seite des Problems besch\u00e4ftigte. Diesem Forscher, der das H\u00e4mocyanin der verschiedensten Tiere, wie Oktopus, Eledone, Saepia. Languste, Krebs und Weinbergschnecke studierte, gelang es. neue Methoden zur Abscheidung bezw. Kristallisation des H\u00e4mocyanins aus dem Blute ausfindig zu machen. Die eint Methode besteht darin, da\u00df das dialysierte Blut elektrolysiert wird, wobei sich das H\u00e4mocyanin abscheidet, die andere beruht darauf, da\u00df sich bei langdauernder Dialyse durch Kollodium hei Eisk\u00fchlung das Oxyh\u00e4mocyanin bei Blut von Helix pomatia in kristallisiertem Zustand,.bei anderen Blutarten in amorphem Zustande, ausscheidet. Ein weiteres Verdienst Dh\u00e9r\u00e9s besteht darin, da\u00df es ihm als Erstem gelang, \u2014 entgegen fr\u00fcheren Behauptungen \u2014\u25a0 zu zeigen, da\u00df das Oxyh\u00e4mocyanin ein cliai akteristisches Spektrum besitzt. Den fr\u00fcheren Forschern war dasselbe infolge der dunklen Farbe und geringen Lichtdurchl\u00e4ssigkeit des Blutes entgangen.\nSoweit standen die Kenntnisse des H\u00e4mocyanins, als ich mich entschlo\u00df, diese Substanz neuerdings zu untersuchen und zu pr\u00fcfen, ob nicht doch etwa ein dem H\u00e4.mochromogen des roten Blutes oder dem Phytochr\u00f6min des Chlorophylles \u00e4hnlich gebauter, aber statt Eisen oder Magnesium, Kupfer enthaltender Komplex im H\u00e4mocyanin auffindbar w\u00e4re.\nMeine erste Sorge galt der Auffindung eines geeigneten Ausgangsmateriales f\u00fcr die Gewinnung von Kupfer enthaltendem Blut. Da das in dieser Hinsicht am besten studierte Material, das auch im Hinblick auf den Arbeitsaufwand beim","page":90},{"file":"p0091.txt","language":"de","ocr_de":"Zur Kenntnis der H\u00e4mocyanine.\ttn\nSezieren die besten Ausbeuten liefert, n\u00e4mlich Oktopus vulgaris gerade in der Adria ziemlich selten ist, so kamen f\u00fcr mich an Seetieren haupts\u00e4chlich Saepia und Eledone in Betracht, von deren Blut ich Proben durch die G\u00fcte des Vorstandes der zoologischen Station in Triest, Herrn Prof. Dr.C. Cori erhielt. Au\u00dferdem war noch die Weinbergschnecke Helix pomatia in Betracht zu ziehen. Nach einigen Vorversuchen und nachdem nnr die Ausarbeitung eines sehr raschen und gute Ausbeuten liefernden Sezierverfahrens gelungen war, entschied ich mich tiir letztere, obwohl eine Trockengewichtsbestimmung f\u00fcr Schneckenblut nur etwa 4%, f\u00fcr Saepiablut aber etwa 8\u00b0 ergeben hatte.\t0\nF\u00fcr die Gewinnung des Blutes hat sich folgendes Ver-laliren als zweckentsprechend erwiesen: Die beste Ausbeute liefert die Weinbergschnecke zur Befruchtungszeit, etwa im Mai. Die Tiere werden in einen Exsikkator gegeben, auf dessen Boden sich \u00c4ther befindet, und beginnen sofort lebhaft Schleim abzusondern, wodurch die sp\u00e4tere Gewinnung reinen Blutes wesentlich erleichtert wird. Nach ca. 10 Minuten befinden sich die Schnecken in einem Zustand tiefer Bet\u00e4ubung und fallen in weit ausgestrecktem Zustand zur Seite. Nun wird die Schale in der Herzgegend vorsichtig abgetragen und das Herz ge\u00f6ffnet. Auf den Schnitt reagieren die Tiere fast \u00b0ar n*c^ llll(* cs flie\u00dfen nur wenige Tropfen Blut aus. Tr\u00e4ufelt man nun wenige Tropfen \u00c4ther auf Kopf und Fu\u00df der Schnecke, so kontrahiert sie sich heftig und pre\u00dft den gr\u00f6\u00dften Teil des Blutes bei raschgehenden Pulsschl\u00e4gen aus. Es empfiehlt sich vorher einen Streifen Filtrierpapier zwischen Fu\u00df uud Mantel-uind zu schieben, um eine allf\u00e4llige Verunreinigung des Blutes durch Schleim oder Exkremente zu verhindern. Auf diese Art erh\u00e4lt man von gro\u00dfen Exemplaren 5\u20146 cm3 Blut bei\neinem Zeitaufwand von etwa 2 Minuten f\u00fcr die Arbeit des Sezierens.\nZun\u00e4chst stellte ich Versuche \u00fcber die Kristallisation verschiedener H\u00e4mocyanine unter verschiedenen Bedingungen an, und zwar bediente ich mich vorwiegend der Dialyse. Meine diesbez\u00fcglichen Erfahrungen decken sich mit den'in-","page":91},{"file":"p0092.txt","language":"de","ocr_de":"92\nErnst Philippi,\nzwischen von Dh\u00e9r\u00e9 ver\u00f6ffentlichten: Saepia- und Eledone-Blut konnte ich ebensowenig zur Kristallisation bringen wie Dh\u00e9r\u00e9, wohl aber gelingt die Abscheidung von kristallisiertem Oxyh\u00e4mocyanin aus Schneckenblut. Die kauf liehen Schleicherund Sch\u00fcllsehen Dialysierh\u00fclsen eignen sich wenig, viel besser arbeitet man mit den von Pregl beschriebenen Dialysatoren1). Beim Arbeiten im Eisschrank mit diesen H\u00fclsen erfolgt Kristallisation in der Regel nach 7\u20149 Tagen.\nTrotz der so einfachen Gewinnung von kristallisiertem Oxyh\u00e4mocyanin war ich nicht in der Lage, meine chemischen Abbauversuche mit kristallisiertem Material auszuf\u00fchren, da mir die Apparaturen zur Verarbeitung gr\u00f6\u00dferer Mengen dieses Materials fehlten. Das kristallisierte Oxyh\u00e4mocyanin geht n\u00e4mlich schon bei Anwesenheit geringster Spuren von Elektrolyten wieder in L\u00f6sung; Dhe'r\u00e9 mu\u00dfte zum Beispiel zur mikroskopischen Untersuchung seiner Kristalle Objekttr\u00e4ger aus Quarz verwenden, da die aus dem Glas herausgel\u00f6sten Spuren von Alkali gen\u00fcgten, um eine teilweise Aufl\u00f6sung der Kristalle zu bewirken. Schlie\u00dflich m\u00f6chte ich noch einen mit Schleicher-und Sch\u00fcl Ischen Dialysierh\u00fclsen ausgef\u00fchrten Versuch erw\u00e4hnen: Bei der Dialyse im Eisschrank erfolgte durch 3 Wochen keinerlei Kristallisation; nach dieser Zeit begann, vom Boden des Gef\u00e4\u00dfes ausgehend, das dunkelblaue Blut sich zu entf\u00e4rben, also Autoreduktion, ohne da\u00df der geringste F\u00e4ulnisgeruch wahrnehmbar gewesen w\u00e4re. Nach 6 Wochen endlich schieden sich in geringer Menge schneewei\u00dfe, prachtvoll ausgebildete rhombische Bl\u00e4ttchen ab, die abzentrifugiert und mit destilliertem Wasser gewaschen wurden. In Wasser, dem eine Spur von Ammonsulfat zugesetzt war, l\u00f6sten sie sich sofort auf. Nach meiner Ansicht lag in diesen Bl\u00e4ttchen kristallisiertes H\u00e4mo-eyanin vor, w\u00e4hrend bisher lediglich kristallisiertes Oxyh\u00e4mocyanin bekannt war.\nWTas die chemische Konstitution des Il\u00e4mocyanins betrifft, so hatten bisher alle Forscher, die sich damit besch\u00e4ftigt hatten, einen Abbau in saurer L\u00f6sung versucht. Auch mein\n\u2019) Pregl, Fermentforschung, Band I, 7-19 (1914).","page":92},{"file":"p0093.txt","language":"de","ocr_de":"Zur Kenntnis der Hamocyanine.\n93\nBestreben war anfangs, in saurer L\u00f6sung entweder eine Suhr stanz mit porphyrinartigem Spektrum oder ein Analogon zu den Teichmannsclien H\u00e4minkristallen zu erhalten. Alle diesbez\u00fcglichen Versuche, die ich mit Blut von Eledone, Saepia und Helix Pomatia anstellte, verliefen vollkommen negativ. Die Hamocyanine sind eben gegen S\u00e4uren sehr empfindlich; Schneckenblut wird schon von wenigen Tropfen l%iger Oxals\u00e4ure momentan entf\u00e4rbt und sicherlich weitgehend ver\u00e4ndert. Unter solchen Umst\u00e4nden lag der Gedanke nahe, den Abbau in alkalischer L\u00f6sung zu versuchen. Ist doch auch derPhytochr\u00f6minkern des Chlorophylls im Gegensatz zum H\u00e4min schon gegen verd\u00fcnnte Oxals\u00e4ure \u00e4u\u00dferst empfindlich, widersteht aber der Einwirkung von starken Alkalilaugen selbst bei Temperaturen von etwa 200\u00b0 0.\nNach wiederholten Vorversuchen schien mir folgende Art\ndes Abbaues die zweckm\u00e4\u00dfigste:\nc \u00ab\n400 g Blut von Helix pomatia wurden mit 40 g pulverisiertem reinen \u00c4tzkali verr\u00fchrt. Dabei verwandelt sich die ganze Masse fast augenblicklich in eine gelb gef\u00e4rbte steife Gallerte. Nach kurzem Erw\u00e4rmen auf 40\u00b0 C. l\u00f6st sich die Gallerte zu einer immer dunkler werdenden klaren Fl\u00fcssigkeit, die im auffallenden Lichte dunkelgr\u00fcn, im durchfallenden rotbraun gef\u00e4rbt ist. Bald beginnt sich ein dunkler Niederschlag abzuscheiden. Derselbe wurde durch wiederholtes Zentrifugieren gereinigt und schlie\u00dflich in Wasser aufgeschlemmt und so lange dialysiert, bis keine alkalische Reaktion mehr wahrnehmbar war. Durch Digerieren in der W\u00e4rme mit verd\u00fcnnter Essigs\u00e4ure wurde der noch vorhandene kohlensaure Kalk entfernt. Es resultierten nun etwa 0,2 g eines dunkelgr\u00fcnen Produktes, das in Wasser, Alkohol, \u00c4ther, Essigester und verd\u00fcnnter Essigs\u00e4ure unl\u00f6slich war, sich aber in Eisessig oder starken Alkalien l\u00f6ste. Diese Substanz enthielt 10,9% Gesamtasche.\nEine mikroanalytische Kupferbestimmung nach Pregl ergab 7,0% Cu (7,01 mg lieferten 0,49\u00b0 mg Cu).\nSchon geringe Spuren dieses K\u00f6rpers gaben intensive Pyrrolreaktion (Fichtenspanreaktion).\nObwohl sicherlich noch kein reiner K\u00f6rper vorlag, so","page":93},{"file":"p0094.txt","language":"de","ocr_de":"94\tErnst Philippi, Zur Kenntnis der H\u00e4mocyanine.\nhalte ich die oben erw\u00e4hnten, bei mehreren Versuchen beobachteten Tatsachen dennoch f\u00fcr einen Hinweis daf\u00fcr, da\u00df auch im H\u00e4mocyanin das Kupfer in \u00e4hnlicher Weise gebunden ist, wie das Eisen im H\u00e4moglobin oder das Magnesium im Chlorophyll. Alle Anzeichen sprechen daf\u00fcr, da\u00df sich der kupferhaltige Komplex in seiner gro\u00dfen Best\u00e4ndigkeit gegen Alkalien und Empfindlichkeit gegen S\u00e4uren mehr dem Ph}\u00b0to-chrominkern des Chlorophylls anschlie\u00dft und daher der alkalische Abbau eher zum Ziele f\u00fchren d\u00fcrfte, wie die S\u00e4urehydrolyse.\nIn der Literatur findet sich ferner eine Angabe1), da\u00df sich im Blute von Pinna squammosa Mangan vorfinde, welches im Pinnaglobin gebunden sei. Seit 40 Jahren findet sich dar\u00fcber keinerlei Angabe mehr. Der Liebensw\u00fcrdigkeit von Herrn Prof. Dr. C. Cori verdankte ich etliche Exemplare von I inna squammosa, mit deren Blut ich einige Vorversuche ausf\u00fchrte. Es ist mir bei diesen Vorversuchen, bei denen ich nur \u00fcber sehr geringe Blutmengen verf\u00fcgte, nicht gelungen, durch Dialyse kristallisiertes Pinnaglobin zu erhalten, wohl konnte ich aber durch Koagulation und Veraschen eines ca. 14 Tage durch Kollodium dialysierten Blutes den Mangangehalt desselben best\u00e4tigen.\nJedenfalls beabsichtige ich, sobald es die \u00e4u\u00dferen Umst\u00e4nde erlauben, dieses Arbeitsgebiet wieder aufzunehmen.\nl) Griffith, Bl. (3) 7, 397.","page":94}],"identifier":"lit20742","issued":"1919","language":"de","pages":"88-94","startpages":"88","title":"Zur Kenntnis der H\u00e4mocyanine","type":"Journal Article","volume":"104"},"revision":0,"updated":"2022-01-31T14:35:23.043398+00:00"}