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{"created":"2022-01-31T14:59:21.864175+00:00","id":"lit20885","links":{},"metadata":{"alternative":"Zeitschrift f\u00fcr Physiologische Chemie","contributors":[{"name":"Thannhauser, S. J.","role":"author"},{"name":"G. Czoniczer","role":"author"}],"detailsRefDisplay":"Zeitschrift f\u00fcr Physiologische Chemie 110: 307-320","fulltext":[{"file":"p0307.txt","language":"de","ocr_de":"Experimentelle Studien fiber den Ineleinstoffireehsel.\nIX Mitteilung.\n\u00dcber den Nachweis and die Beetimmvng tob gehudenen and freien Pnrinen in monsohliohon Bint- and Bitorstr\u2014* *,\nVon\nS. J. Thannhanser and 6. Cionicser\u00ab\n(Aas der U. med. Klinik (F. M\u00fcller), M\u00fcnchen.)\n(Der Redaktion angegangen am 8. August 1910.)\nDie Polynucleotide werden im menschlichen D\u00fcnndarm zu einfachen, wasserl\u00f6slichen Nucleotidkomplexen aufgespalten (Thannhauser und Dorfmfiller1). Die gro\u00dfe Wasserl\u00f6slichkeit der durch die D\u00fcnndarmverd&uung entstandenen einfachen Nucleotidkomplexe und das Fehlen von tiefergehenden Spalt-prodjikten macht es wahrscheinlich, da\u00df keine freien Purinbasen, sondern die pr\u00e4formierten Purinzuckerphosphors\u00e4urekomplexe zur Resorption und in den intermedi\u00e4ren Stoffwechsel gelangen. In gleichem Sinne sprechen die subkutanen Injektionen der Nucleoside, Guanosin und Adenosin (Thannhauser und Bommes, Severin1). W\u00e4hrend bei der Verf\u00dctterung der freien Aminopurine (Minkowski, Kr\u00fcger und Schmidt, Brugsch und Schittenhelm1) nur ein geringer Bruchteil als Harns\u00e4ure im Urin wieder erscheint, werden die Vorstufen\n0 Thannhaustr and Dorfmtlller, Diese Zeitachr. Bd. 91, S. 829; Bd. 95, S. 259; Bd. 100, S. 121.\n*) Thannhanser and Bommes, Diese Zeitachr. Bd.91, S.886.\u2014 Severin, Hab.-Schrift, Brealaa 1916.\n*) Minkowski, Arch. f. exp. Pharm, u. Path. Bd. 20, & 41 (1886); Bd. 51, 8.214 (1895). \u2014 Kr\u00fcger and Schmidt, Diese Zeitachr. Bd.34, 8. 549 (1902). \u2014 Brngsch and Schittenhelm, Np\u00e7lftinHoffyechgfl, 6. Fischer, Jena, 8.88 (1910).","page":307},{"file":"p0308.txt","language":"de","ocr_de":"308\tS. J. Thannhaaser and G. Czoniczer,\nder \u00c2mmopurine, das Guanosin und Adenosin, nach subkutaner Injektion nahezu vollst\u00e4ndig als Harns\u00e4ure ausgeschieden. Die freien Aminopurine d\u00fcrften wegen ihrer schweren L\u00f6slichkeit nur ganz unvollst\u00e4ndig zur Resorption gelangen. Sie werden durch die Bakterienflora der unteren Dannabschnitte, welche den Purinring aufzuspalten imstande ist, vollst\u00e4ndig zersetzt und der im Purinring enthaltene Stickstoff als Ammoniak abgespalten (Thannhauser und Dorfm\u00fcller1 *).\nDiese Untersuchungsergebnisse f\u00fchrten uns zu der Annahme, da\u00df im kreisenden Blute neben dem Endprodukt des Purinstoffwechsels, der Harns\u00e4ure, auch ihre Vorstufen, die in Nucleotid-form gebundene Purine, wie sie vom Darm her in den intermedi\u00e4ren Stoffwechsel gelangen, nachzuweisen nnd zu bestimmen sein m\u00fcssen. F\u00fcr diese Anschauung spricht bereits ein experimenteller Befund, den R. Ba\u00df1) erhoben hat. Ba\u00df fand im Blut nach vorangegangener S\u00e4urespaltung nicht unbetr\u00e4chtliche Purinmengen, die durch die S\u00e4urehydrolyse aus Nucleotid-komplexen sekund\u00e4r abgespalten sein d\u00fcrften. In neuerer Zeit gibt Benedict3) f\u00fcr das Tierblut und Griesbach4) unter Ben\u00fctzung der Benedict sehen Methode f\u00fcr das Menschenblut an, da\u00df neben freier auch gebundene Harns\u00e4ure vorhanden sei. Der Benedictsche Nachweis der gebundenen Harns\u00e4ure geschieht in der Art, da\u00df im enteiwei\u00dften Serum vor und nach dem Kochen mit Minerals\u00e4uren die Harns\u00e4ure nach dem Folin-Denisschen Verfahren mit Phosphorwolframs\u00e4ure kolo-rimetrisch bestimmt wird. Bei derNachpr\u00fcfung der Ben ed i c t-schen Methode an L\u00f6sungen reiner Purinzuckerverbindungen (Nucleosiden) konnten wir nachweisen, da\u00df zwar Guanin, Ade-nin und Xanthin wie auch die Nucleoside: Guanosin, Adenosin und Xanthosin mit P.W.S. nur eine geringe Blauf\u00e4rbung erkennen lassen, da\u00df aber Guanosin, Adenosin und Xanthosin mit Mineral8\u00e4ure gekocht die gleiche intensive Blauf\u00e4rbung mit\n*) Thannhauser nnd Dorfm\u00fcller, Diese Zeitschr. Bd. 102, iS. 148 (1918).\n*) R. Ba\u00df, Arch. f. exp. Pharm, n. Path. Bd. 76.\n*) Benedict, Chem. Centralblatt Bd. 2, S. 675 (1915).\n4) Griesbach, Kongre\u00df f. innere Medizin, Dresden 1920.","page":308},{"file":"p0309.txt","language":"de","ocr_de":"Experimentelle Stadien aber den Naelemstoffirechsel. IX.' 309\nP. W. S. wie dieHarns\u00e4ure zeigen. Das Benedietache Verfahren kann somit nicht zum Nachweis von gebundener Harns\u00e4ure herangezogen werden.\nEine Methode des Nachweises und der Bestimmung der gebundenen Purink\u00f6rper im Blute mu\u00df sich auf eine exakte, quantitative Bestimmung der freien Purine (mit Einschlu\u00df der Harns\u00e4ure) st\u00fctzen. Die Voraussetzung f\u00fcr eine solche Methode ist in den heute \u00fcblichen Purinf\u00e4llungsmethoden nach Ludwig-Salkowski und Kr\u00fcger-Schmidt gegeben.\nF\u00fcr alle Untersuchungen, die sich mit der Methodik des Purinnachweises im Blute befa\u00dften, glied\u00e8rt sich das Problem der quantitativen Bestimmung in drei Aufgaben: 1. Die Enteiwei\u00dfung des Serums, 2. die F\u00e4llung der Purink\u00f6rper, 3. die quantitative Aufarbeitung der Purinf\u00e4llung.\nBestimmung der freien Purine (inkl. Harns\u00e4ure)\nim Blutserum.\nF\u00fcr die Frage der Enteiwei\u00dfung war zuerst zu untersuchen, welche Enteiwei\u00dfungsmethode die Nucleotide mitaus-f\u00e4llt und nur die freien Purine in L\u00f6sung bel\u00e4\u00dft. In Tastversuchen an Purin- und Pyrimidinnucleotiden (Adenosin- und Uridinphosphors\u00e4ure)1) konnten wir feststellen, da\u00df diese Substanzen vollst\u00e4ndig durch Uranylacetat gef\u00e4llt werden, w\u00e4hrend Harns\u00e4ure und Aminopurine in verd\u00fcnnten L\u00f6sungen, wie sie im Blut zu erwarten sind, keine F\u00e4llung mit Uranylacetat geben. Die Nucleoside, Guanosin, Adenosin etc., fallen \u2022 mit Uranylacetat in geringprozentigen L\u00f6sungen zwar auch nicht und w\u00fcrden neben den freien Purinen im enteiwei\u00dften Serum in L\u00f6sung bleiben. Da es uns aber nicht gelungen ist, einen qualitativen Nachweis von Nudeosiden im Serum zu f\u00fchren, so k\u00f6nnen wir annehmen, in einem mit Uranylacetat enteiwei\u00dften Serum nur die freien Purine in L\u00f6sung zu haben. F\u00fcr die Enteiwei\u00dfung benutzten wir l,55\u00b0/0ige Uranylacetatl\u00f6sung (Oszaki*), indem wir auf 1 Teil Serum 1 Teil Wasser und\n0 S. J. Thannhausen Diese Zeitsckr. Bd. 107, S. 158 (1919). \u2019) Osxski, Zeitschr. f. Elin. Med. Bd. 77, 8.913.\nHoppe-Seyler\u2019s Zeitschrift f. physiol. Chemie. CX.\t23\t*","page":309},{"file":"p0310.txt","language":"de","ocr_de":"310\tS. J. flannhiustr and 6. Czoniczer,\n1 Teil Uranylacetatl\u00f6sung verwendeten. Das Filtrat ist biuret-frei und kann ohne Niederschlagsbildung auf ein kleines Volumen eingeengt werden.\nF\u00fcr die F\u00e4llung der Purine stehen 2 Methoden zur Verf\u00fcgung: Die F\u00e4llung mit ammoniakalischer Silbernitratl\u00f6sung nach Ludwig-Salkowski1) und die Methode nach Kr\u00fcger-Schmidt*), wobei die Purine mit Kupfersulfat und Natrium-bisulfit in ann\u00e4hernd neutraler L\u00f6sung niedergeschlagen werden. Der Vorzug der Lud wigschen Methode ist ihre gro\u00dfe Spezifit\u00e4t, ihr Nachteil aber, da\u00df man nur in Purinl\u00f6sungen von relativ hoher Konzentration eine quantitative F\u00e4llung bekommt. Unsere ersten Versuche begannen wir an einer Haras\u00e4ure-Testl\u00f6sung, die 20 mg%ig war. Eine Konzentration, die noch h\u00f6her ist, als wir sie in einem auf den 3. Teil eingeengten Serum eines gesunden Individuums zu erwarten h\u00e4tten. Bei der Verarbeitung des Silberniederschlages (N-Bestimmung in einem Mikrokjel-dahlapparat nach vorherigem Kochen mit MgO) erhielten wir kleinere N-Werte, als der angewandten Substanzmenge entsprach. Die Silberf\u00e4llung war trotz Zugabe \u00fcbersch\u00fcssiger Silberl\u00f6sung und peinlicher Vermeidung einer zu stark ammonia-kalischen Reaktion nicht vollst\u00e4ndig. Die Konzentration von 20 mg\u00ae/* ist zu klein, um eine quantitative Ausf\u00fcllung nach Ludwig-Salkowski zu bekommen. Auf Grund dieser Versuche d\u00fcrfte bei der niederen Purinkonzentration im Blutserum die Silberilllung auch in stark eingeengten Sera zu kleine Werte geben*. Befriedigende Resultate erreichten wir mit dem Kr\u00fcgerschen Verfahren. Wir verwendeten 10 ccm Testl\u00f6sung = 2 mg Harns\u00e4ure (\u00dc) und erhielten in 3 Parallelversuchen: I = 1,97 mg \u00dc, II = 1,97 mg \u00dc, HI = 2,0 mg \u00dc zur\u00fcck. Die Kupfersulfat-Bisulfitf\u00e4llung ist auch in Purinl\u00f6sungen geringer Konzentration vollst\u00e4ndig.\n*) Ludwig-Salkowski, Zeitschr. f. anal. Chem. Bd. 21, S. 148; Virchows Archiv Bd. 52, S. 60.\n*) Kr\u00fcger-Schmidt, Diese Zeitschr. Bd. 45.\n*) Dies d\u00fcrfte auch der Grund sein, warum man fr\u00fcher bei Anwendung der Silberf\u00e4llung sur Harasfturebestimmung im Blutserum nur geringe Mengen oder gar keine Harns\u00e4ure fand.","page":310},{"file":"p0311.txt","language":"de","ocr_de":"Experimentelle Stadien fiber den Nncleinstoffwechsel. IX. 3H\nZur quantitativen Bestimmung des PuringehalteedesKupfer-niederschlages verwendeten wir die N-Bestimmung nach Kjel-dabl in einer Mikroapparatur \u00e4hnlich der Bangsehen, wie sie von Lautenschl\u00e4ger unter der Bezeichnung \u201eII. med. Klinik\u201c geliefert wird. Die Titration mit */ioo n. L\u00f6sungen (1 ccm * 0,00014 g N) gibt einwandfreie Resultate auch f\u00fcr die kleinsten N-Mengen. Da\u00df au\u00dfer den Purinen keine wesentlichen Mengen anderer stickstoffhaltiger Substanzen durch den Cu-Niederschlag mitgef\u00e4llt werden, soll weiter unten in der Kritik der Methode ausgef\u00fchrt werden.\nDie Bestimmung der freien Purine f\u00fchrten wir auf folgende Weise aus: Das aus der Cubitalvene entnommene Blut (100\u2014150 ccm) wird in einem hohen Zylinder gut verkorkt im Eisschrank mehrere Stunden aufbewahrt, bis sich das Serum gut abgesetzt hat. Sollte sich das Serum nicht rasch und klar absetzen, so ist es abzuzentrifugieren. 40 ccm Serum werden p\u00fcnktlichst in gleichen Teilen mit destilliertem Wasser und L55 %iger Uranylacetatl\u00f6sung verd\u00fcnnt und vom Niederschlag abfiltriert (Verd\u00fcnnung 1:3). Von dem wasserklaren, biuret- * freien Filtrat, das keine Spuren von Eiwei\u00df, jedoch die Purine quantitativ enth\u00e4lt, werden 60 ccm mit einer Pipette in ein kleines Becherglas von 200 ccm Inhalt abgemessen und auf ca. 15 ccm auf dem Wasserbade eingeengt. Die Fl\u00fcssigkeit bleibt vollst\u00e4ndig klar. Hierauf wird eine Messerspitze (ca. 0,5 g) chemisch reines Natriumacetat und 1 ccm 40%ige (k\u00e4ufliche) Natriumbisulfitl\u00f6sung zugegeben und aufgekocht. Sobald die Mischung stark kocht (nicht eher, da sonst die F\u00e4llung leicht kolloidal bleibt) wird 1 ccm 10\u00ae/0ige Kupfersulfatl\u00f6sung (Kupfersulfat chemisch rein) zugesetzt und die Mischung 3\u20144 Minuten in kr\u00e4ftigem Kochen gehalten. Es entsteht eine dunkelbraune F\u00e4llung, die deutlich erkennbar aus 2 Komponenten besteht. Der gr\u00fcnlichbraune, feink\u00f6rnige Niederschlag ist CuO, der gnm-braune flockige Niederschlag ist die eigentliche Purinf\u00e4llung. Nach vollst\u00e4ndiger Abk\u00fchlung wird Niederschlag und Fl\u00fcssigkeit in ein ca. 50 ccm fassendes Zentrifugierglas quantitativ gesp\u00fclt. Der Niederschlag l\u00e4\u00dft sich vorz\u00fcglich zentrifugieren. Die \u00fcberstehende Fl\u00fcssigkeit ist wasserklar und l\u00e4\u00dft\n28*\n1","page":311},{"file":"p0312.txt","language":"de","ocr_de":"312\tS* J. Thannhftaser and G. Gzoniczer,\nsich abgie\u00dfen, ohne da\u00df me\u00dfbare Mengen des Bodensatzes verloren gingen, was durch die vollst\u00e4ndige \u00dcbereinstimmung der Parallelversuche bewiesen wird. Der Niederschlag wird w\u00e4hrend einer Stunde auf der elektrischen Zentrifuge zentrifugiert und 4\u20145mal mit destilliertem Wasser gewaschen. Der auf diese Weise von den letzten Spuren des Serums befreite Niederschlag wird mittels eines kleinen Trichterchens quantitativ in dem Mikrokjeldahlkolben gesp\u00fclt, wozu nicht mehr als 50\u201460 ccm Wasser ben\u00f6tigt werden sollen. Nach Zusatz von 1 ccm konz. Schwefels\u00e4ure, einigen Krist\u00e4llchen Kupfersulfat und Kaliumsulfat wird auf kleiner Flamme eingedampft. Sobald die Veraschung beginnt, wird die Flamme vergr\u00f6\u00dfert. Nach ca. 2 Stunden ist die ganze Operation beendigt. Bei der nun folgenden Destillation werden 10 ccm Vioo n* HCl vorgelegt. Von der Zahl der verbrauchten ccm HCl mu\u00df die Menge abgezogen werden, welche \u201eLeerversuche\u201c ergeben. \u2014 Beim Leerversuch werden 10 ccm destilliertes Wasser, eine Messerspitze Natriumacetat und 1 ccm Bisulfitl\u00f6sung gekocht und zur kochenden Fl\u00fcssigkeit 1 ccm Kupfersulfatl\u00f6sung zu* gesetzt. Es entsteht ein aus CuO bestehender brauner Niederschlag, der auf die oben beschriebene Weise abzentrifugiert und kjeldahlisiert wird. Bei unseren Blindversuchen bekamen wir meistens einen Ausschlag von 0,4 ccm 1/lm n. HCl. Da jedoch diese Zahl mit der Reinheit der Reagenzien wechseln kann, ist der Leerversuch bei Verwendung neuer Reagenzien stets zu wiederholen.\nDie Ausrechnung der Bestimmung geschieht auf folgende Weise; Angenommen, wir verarbeiteten 60 ccm des 1 ; 3 ent-eiwei\u00dften Serums und verbrauchten beimKjeldahlisieren 3,4 ccm 7,00 HCl, so ist diese Zahl nach Abziehung des Leerversuchswertes (0,4 ccm) mit 5 zu multiplizieren, um auf die HC1-Menge zu kommen, die 100 ccm Serum entspricht (3 X 5 = 15 ccm HCl). Diese Zahl (15 ccm) ist mit 0,14 zu multiplizieren, um den Purinstickstoffwert in mg% zu erhalten\n(=*2,1 mg\u00b0/0 Purin N).\nZur Kritik dieser Methode m\u00fcssen wir folgende Einw\u00e4nde beantworten: 1. Lassen sich die mittels Kupferf\u00e4Uung nieder-","page":312},{"file":"p0313.txt","language":"de","ocr_de":"Experimentelle Stadien \u00fcber den Nucleinstoffwechsel. IX. 313\ngeschlagenen Purine mit gen\u00fcgender Genauigkeit auf die angegebene Weise bestimmen? Werden durch die Kupferf\u00e4llung nicht auch andere N-haltige Substanzen mitgeflUlt und als Purine berechnet?\nAuf die erste Frage geben schon die oben erw\u00e4hnten Vorversuche mit 20 mg % Harns\u00e4urel\u00f6sung eine befriedigende Antwort. Um aber die Vollst\u00e4ndigkeit der F\u00e4llung auch im Serum zu beweisen, setzten wir dem Serum noch vor der Enteiwei\u00dfung Harns\u00e4ure zu. Dabei fanden wir von 4 mg zugesetzter Harns\u00e4ure 3,9 mg (97,5 %), von 3,3 mg zugesetzter Harns\u00e4ure 3,1 mg (94%) zur\u00fcck. Zugleich ist hierdurch der Beweis erbracht, da\u00df beim Zentrifugieren und den sonstigen Manipulationen vom Niederschlage nichts verloren geht und da\u00df das Mikrokjeldahlverfahren mit Vioo n- L\u00f6sungen eine gen\u00fcgende Genauigkeit f\u00fcr die Erfordernisse einer quantitativen Bestimmung des Purinstickstoffes Gew\u00e4hr leistet.\nDer zweite Einwand, da\u00df die Kupferf\u00e4llung auch andere N-haltige Substanzen des enteiwei\u00dften Serums au\u00dfer Purinen enthalten k\u00f6nnte, ist schon fr\u00fcher gegen ^ Kr\u00fcger -Schmidt sehe Verfahren erhoben worden (Huppert *). Wir versuchten nochmals, L\u00f6sungen der in Frage kommenden Substanzen Kreatin, Kreatinin, Aminos\u00e4uren (Glykokoll, Alanin), Albumosen mit Kupferbisulfit zu f\u00e4llen, konnten aber durchweg die erhaltenen CuO-Niederschl\u00e4ge als N-frei befinden. Gegen die Beimengungen nicht purinhaltiger K\u00f4rp\u00ear spricht auch der Vergleich unserer Resultate mit den Werten,' die man bei den gleichen Sera mit der Folin-Denisschen Phos-phorwolframs\u00e4urekolorimetrie nach der Neubauerschen Modifikation der direkten Kolorimetrie im enteiwei\u00dften S\u00e9rum erh\u00e4lt. Wir rechneten den Purinstickstoff in seiner Gesamt\u00bb heit auf Harns\u00e4ure um und fanden folgende Zahlen:\nKolorimetrisch . Purinstickstoff . auf Harns\u00e4ure berechnet .\n3,0 mg % \u00dc 1,05 mg % P.N.\n3,15 mg % \u00dc\n6,6 mg % U 2,3 mg % P.N.\n6,9 mg % \u00dc\n9,8 mg % U 3,3 mg \u00b0/0 P.N.\n10,0 mg % \u00db\n13,6 mg \u00b0/0 \u00d6 4,4mg%P*N.\n13,2 mg %\u00dc\n*) Huppert, Diese Zeitschr. Bd. 22, S. 556 (1897).","page":313},{"file":"p0314.txt","language":"de","ocr_de":"314\tS. J. Thannhauser and G. Czoniczer,\nDer unbedeutende Unterschied zwischen deni kolorimetri-schen Hamsfturewert im Serum und der aus dem Purinstick-stoffwert errechneten Harnsfturezahl zeigt, da\u00df neben der Harns\u00e4ure nur geringe Mengen freier Purine im Blutserum Vorkommen, und da\u00df man praktisch den nach dem oben beschriebenen Verfahren im Blutserum ermittelten Purinstickstoffwert in Harns\u00e4ure umrechnen kann. Die vergleichende Untersuchung der Purinstickstoffbestimmung und der direkten Kolorimetrie in dem mit Uranylacetat enteiwei\u00dften Serum erweist gleichzeitig die Brauchbarkeit de* einfachen, wenig zeitraubenden P.W.S.-\u00a3olorimetrie zur Harns\u00e4urebestimmung, wenngleich das von uns ge\u00fcbte titrimetrische Verfahren den Vorzug der Objektivit\u00e4t hat.\nEs soll aber nicht verschwiegen werden, da\u00df in einer kleinen Zahl der untersuchten F\u00e4lle mit unserer Methode sich etwas gr\u00f6\u00dfere Stickstoffwerte f\u00fcr die freien Purine fanden, als der kolorimetrisch ermittelten Harns\u00e4urezahl entsprechen w\u00fcrde. Da\u00df in diesen F\u00e4llen neben Harns\u00e4ure auch andere Purine vorhanden waren, zeigen zwei andere Versuche, die wir mit Eiterserum anstellten. Hierbei zeigten sich gro\u00dfe Unterschiede zwischen dem Puringehalt und dem kolorimetrisch ermittelten Harns\u00e4urewert. In dem ersten dieser F\u00e4lle fanden wir 3 mg Harns\u00e4ure kolorimetrisch, mit unserer Methode hingegen 3,5 mg % Purinstickstoff, was auf Purine umgerechnet 10,5 mg % Purine1) bedeuten w\u00fcrde, also abz\u00fcglich der vorhandenen Harns\u00e4ure ca. 7 mg % Purine. In einem zweiten Fall 3,3 mg % Harns\u00e4ure kolorimetrisch und 14,6 mg % Purinstickstoff nach unserm Verfahren (nach Abzug des kolorimetrisch ermittelten Harns\u00e4urewertes ca. 40,5 mg % Purine).\nl) Die errechneten Purinzahlen sind analog der Harns\u00e4ureberechnung durch Multiplikation des P. N. mit 3 erhalten. Da die verschiedenen Purine verschiedenen Stickstoffgehalt haben, liegt dieser Zahl keine vollst\u00e4ndig genaue Berechnung zugrunde.","page":314},{"file":"p0315.txt","language":"de","ocr_de":"Experimentelle Stadien aber den Nucleinitoffwechsel. IX. 31g\nNachweis und Bestimmung der gebundenen Purine (Nucleotide) im Blutserum.\nDer qualitative Nachweis von Nucleotiden d\u00fcrfte als erbracht gelten, wenn aus einer L\u00f6sung die Nucleotide durch eine m\u00f6glichst spezifische F\u00e4llungsreaktion niedergeschlagen werden und in dem Niederschlage nach Zersetzung mit S\u00e4uren die Bausteine der Nucleotide, Purine, Zucker, Phosphors\u00e4ure sich durch spezifische Reaktionen nachweisen lassen. Die Schwierigkeit, die Nucleotide im Blut- oder Eiterserum zu fassen, liegt in der Wahl der geeigneten Enteiwei\u00dfungs-methode. Unsere Vor versuche an reinen L\u00f6sungen von Adenosinphosphors\u00e4ure und Triphosphonucleins\u00e4ure zeigten, da\u00df diese Substanzen durch alle Metalle und Metallsalzl\u00f6sungen mehr oder minder vollst\u00e4ndig ausgef\u00e4llt werden. Enteiwei\u00dfungsmethoden mit Metallsalzl\u00f6sungen k\u00f6nnen somit f\u00fcr unsere Zwecke nicht in Frage kommen. Auch die Phosphorwolframs\u00e4ure fallt die Nucleotide zum Teil aus. Arbeitet man wie Ba\u00df mitP.W.S. in stark mineralsauren L\u00f6sungen, so werden die Nucleotide zersetzt. Man erh\u00e4lt wohl hohe Purinwerte, aber ein zwingender Nachweis, da\u00df diese Purine vorher in gebundener Form vorhanden waren, ist nicht zu erbringen. Die Enteiwei\u00dfung des Serums zum Nudeotidnachweis mu\u00df in schwachsaurer (ja nicht mineralsauer!) L\u00f6sung stattfinden. Die alte Methode durch Kochen und Zusatz von einigen Tropfen verd\u00fcnnter Essigs\u00e4ure liefert keine vollst\u00e4ndig eiwei\u00dffreien Filtrate. Beim Einengen fallen hier immer noch flockige Tr\u00fcbungen aus. Durch Enteiwei\u00dfen mit 15%iger Trichlor-essigs\u00e4ure in der K\u00e4lte bekamen wir vollst\u00e4ndig klare und eiwei\u00dffreie Filtrate, jedoch hemmt die Trichloressigs\u00e4ure im eingeengten Filtrat die nachfolgende Kupferf\u00e4llung. Mehrere Versuche, mit 20%iger Sulfosalizyls\u00e4ure in der K\u00e4lte zu enteiwei\u00dfen, zeigten, da\u00df zur vollst\u00e4ndigen Enteiwei\u00dfung ein Uberschu\u00df von Sulfosalizyls\u00e4ure n\u00f6tig ist, so da\u00df sie beim Einengen in dicken Kristallb\u00fcscheln wieder ausf\u00e4llt und die Weiterverarbeitung st\u00f6rt. Eine Kombination der Hitzekoagulation mit Zusatz von einigen ccm Sulfosalizyls\u00e4ure ergab","page":315},{"file":"p0316.txt","language":"de","ocr_de":"316\tS. J. Thannhauser und 6. Czoniczer,\nendlich die geeignete Methode, um schwachsaure, eiwei\u00dffreie Filtrate, die sich ohne Niederschlagbildung einengen lassen, zu erzielen.\nDie Nucleotide werden aus ihren L\u00f6sungen durch Metallsalze gef\u00e4llt. Die bei ihrer chemischen Herstellung gebr\u00e4uchliche Methode, sie mit basisch essigsaurem Blei zu fallen, ist im enteiwei\u00dften Blutserum nicht ang\u00e4ngig, da der Bleiessig auch andere N-haltige Bestandteile mitrei\u00dfen w\u00fcrde. Ammo-niakalische Silbernitratl\u00f6sung fallt die in geringer Konzentration vorhandenen Nucleotide nur unvollst\u00e4ndig. Hingegen konnten wir an einer 0,1 \u00b0/#igen Testl\u00f6sung von kristallisierter Adenosinphosphors\u00e4ure zeigen, da\u00df diese Substanz durch Kupfersulfat und Bisulfit ebenso wie die freien Purine niedergeschlagen wird. 10 mg Adenosinphosphors\u00e4ure wurden mit Kupfer- und Bisulfit nach den weiter unten angegebenen Vorschriften gef\u00e4llt und in zwei Kontrollversuchen 9,0 mg und 8,8 mg zur\u00fcckgefunden. Somit entgeht der F\u00e4llung nur ein geringer Bruchteil des Nucleotids. Durch diesen Befund war gleichzeitig ein Hinweis gegeben, wie man gebundene und freie Purine nebeneinander bestimmen kann. In dem ersten Falle Enteiwei\u00dfung in saurer L\u00f6sung, im zweiten Fall Enteiwei\u00dfung mit Metallsalzen(Uranylacetat) wie oben beschrieben. Die Unterschiede der Purinstickstoffwerte im sauer enteiwei\u00dften und in dem mit Metallsalz enteiwei\u00dften Serum d\u00fcrften den Gehalt des Serums an * gebundenen Purinstickstoff\" ergeben.\nEs war nunmehr der qualitative Nachweis zu f\u00fchren, ob tats\u00e4chlich in dem durch Hitzekoagulation unter Sulfosalizyl-s\u00e4urezusatz enteiwei\u00dften Serum der Kupferniederschlag Nucleotide enth\u00e4lt. In Parallelversuchen wurden 600 ccm Eiterserum und 300 ccm Blutserum durch Hitzekoagulation unter Sulfosalizyls\u00e4urezusatz enteiwei\u00dft, die Filtrate auf Vs ihres Volumens eingeengt und mit Kupfersulfat und Bisulfit gef\u00e4llt. Die Niederschl\u00e4ge wurden bei neutraler Reaktion mit Schwefelwasserstoff zersetzt, filtriert und im Vakuum vollst\u00e4ndig eingeengt. Die gelben R\u00fcckst\u00e4nde beider Sera gaben starke gelbrote Murexidprobe. Ein Teil wurde mit 5\u00b0/0iger Minerals\u00e4ure in der Hitze aufgenommen. Diese L\u00f6sungen gaben mit","page":316},{"file":"p0317.txt","language":"de","ocr_de":"Experimentelle Stadien \u00fcber den Nucleinstoffwrechsel. IX. 317\nResorcin eine dunkelrote Zuckerprobe, mit Orcin eine braunrote Verf\u00e4rbung. Die Phosphors\u00e4urereaktion mit Ammonium-molybdat war gleichfalls stark positiv. Durch den Ausfall dieser Reaktionen im zersetzten Eupferniederschlag des Blut-und Eiterserums ist der qualitative Nachweis von Nucleotiden im Serum von uns erbracht.\nDie Bestimmung der in Nucleotidform im Blutserum gebundenen Purine wird in folgender Weise ausgef\u00fchrt:\n30 ccm Serum (f\u00fcr 30 ccm Serum sind ca. 100 ccm Vollblut n\u00f6tig) werden mit einer Pipette genau abgemessen und mit 55 cm dest. Wasser verd\u00fcnnt. Die Mischung wird kurz aufgekocht und in dem Augenblick des Aufkochens 5 ccm 20%ige Sulfosalizyls\u00e4urel\u00f6sung zugegeben. Beim Erhitzen wird auf dem Erlenmeyerkolben als K\u00fchler ein Trichterchen mit der Spitze nach unten gesetzt, so da\u00df keine me\u00dfbare Menge Wasser verdampfen kann. (30 ccm Serum + 55 ccm Wasser + 5 ccm Sulfosalizyls\u00e4ure gibt eine Verd\u00fcnnung von 1:3. 3 ccm Filtrat = 1 ccm Serum.) Die koagulierte Mischung mu\u00df in Eis vollst\u00e4ndig abgek\u00fchlt werden, da sie nur kalt sch\u00f6n zu filtrieren ist. Das gewonnene Filtrat ist wasserklar und eiwei\u00dffrei. Das Filtrat gibt zwar mit Uranylacetat und P.W.S.-L\u00f6sung eine Tr\u00fcbung, die jedoch nicht von Eiwei\u00df-k\u00f6rpem herr\u00fchrt, da diese Reagenzien auch andere Substanzen, unter denen die von uns gesuchten Nucleotide sind, zu fitflen verm\u00f6gen. \u2014 50 ccm des Filtrates werden in ein 200 ccm fassendes Becherglas abpipettiert und auf dem Wasserbade bis ca. 15 ccm eingeengt. St\u00e4rkeres Einengen mu\u00df vermieden werden, da sonst die Konzentration der Sulfosalizyls\u00e4ure eine H\u00f6he erreicht, die hemmend auf die Kupferf\u00e4llung wirken w\u00fcrde. Beim Einengen wird die Fl\u00fcssigkeit etwas tr\u00fcbe. Die Tr\u00fcbung verschwindet bei dem nun folgenden Aufkochen, so da\u00df die Kupferf\u00e4llung in einer klaren L\u00f6sung erfolgt. Die Kupferf\u00e4llung wird auf die gleiche Weise ausgef\u00fchrt, wie dies oben bei der F\u00e4llung der freien Purine beschrieben wurde. Der grobflockige, dunkelbraune Kupferniederschlag setzt sich rasch ab, die \u00fcberstehende Fl\u00fcssigkeit ist vollkommen durchsichtig. Sollte dies nicht der Fall sein und ein kolloidaler","page":317},{"file":"p0318.txt","language":"de","ocr_de":"318\tS. J. Thannhanstr und 6. Czoniczer,\nnicht zentrifugierbarer Niederschlag entstehen, so ist dies ein Zeichen, da\u00df im Verfahren ein Fehler begangen wurde. Entweder wurde das Filtrat zu stark eingeengt oder die Kupfersulfatl\u00f6sung wurde zugesetzt, bevor die Fl\u00fcssigkeit in vollem Kochen war. Der Kupferniederschlag wird eine Stunde lang zentrifugiert, die Waschfi\u00fcssigkeit viermal abgegossen und wieder aufgef\u00fcllt. Der auf diese Weise in der Zentrifuge gewaschene Niederschlag wird, wie oben beschrieben, in ein Mikrokjeldahlk\u00f6lbchen quantitativ gesp\u00fclt und verascht.\nAls Muster f\u00fcr die Berechnung sei folgendes Beispiel ausgef\u00fchrt: 50 ccm Filtrat verbrauchen 4,4 ccm l/im n. HCl, nach Abzug des Leerversuchwertes 4,0 ccm. Da die Verd\u00fcnnung 1: 3 war, besteht die Gleichung: 50/3:4 = 100 : x. Die f\u00fcr x erhaltene Zahl (24) ist mit 0,14 zu multiplizieren. Die auf diese Weise berechnete Zahl (3,36 mg %) ist der gesamte Stickstoffwert f\u00fcr die freien und gebundenen Purine des Serums (G. N.). Zieht man von diesem Wert die mit der oben beschriebenen Methode (Uranylacetatenteiwei\u00dfung) gefundene Zahl des freien Purinstickstoffs (P.N.) ab, so erh\u00e4lt man den Nucleotidstickstoffgehalt (N.N.) des Blutserums. So lassen zum Beispiel 3,6 mg % GK N. (Gesamtpurinstickstoff) und 1,2 mg % P.N. nach der Gleichung\nN.N. = G.N. - P.N.\n2,4 mg % N.N. (Nucleotid8tickstoff) berechnen.\nZur Kritik der Methode k\u00f6nnen zwei Einw\u00e4nde gemacht werden. 1. Enth\u00e4lt das auf die oben angegebene Weise ent-eiwei\u00dfte Serum keine andern Bestandteile, die mit Kupfer-Bisulfit fallen? 2. Werden die im Serum vorhandenen Nucleotide mit Kupfersulfat-Bisulfit vollst\u00e4ndig ausgef\u00e4llt?\nZu dem ersten Einwand mu\u00df gesagt werden, da\u00df im wasserklaren Filtrat manchmal Spuren einer Biuretreaktion vorhanden waren. Als Ursache dieser Reaktion k\u00f6nnte man kleine Mengen von Albumosen, die sich bei der Hitzekoagulation abgespalten h\u00e4tten, vermuten. Eine 0,5\u00b0/\u00abige Albumose* l\u00f6sung wurde deshalb hergestellt und mit Kupfersulfat-Bisulfit gef\u00e4llt. Der Kupferniederschlag gibt keinen Ausschlag beim","page":318},{"file":"p0319.txt","language":"de","ocr_de":"Experimentelle Stadien fiber den Nucleinstoffwechsel. OL 319\nKjeldahlisieren, Da\u00df au\u00dfer Purinen und Nucleotiden im ent-eiwei\u00dften Serum keine me\u00dfbaren Mengen anderer stickstoffhaltiger Substanzen enthalten sind, die mit Eupfer-Bisulfit fallen, wurde bereits oben durch Versuche bewiesen.\nUm den zweiten Einwand zu entkr\u00e4ften, setzten wir dem Serum vor dem Enteiwei\u00dfen Adenosinphosphors\u00e4ure zu. Wir verfuhren dabei so, da\u00df wir das Serum vor der Koagulation anstatt mit 'destilliertem Wasser mit 0,l#/oiger Adenosinphosphors\u00e4urel\u00f6sung verd\u00fcnnten. Dabei fanden wir von 7,5 mg zugesetzter Adenosinphosphors\u00e4ure 6,5 mg, in einem zweiten Versuch von 6,7 mg zugesetzter Adenosinphosphors\u00e4ure 5,8 mg zur\u00fcck. Es ist also mit Sicherheit anzunehmen, da\u00df bei derselben Versuchsanordnung auch die pr\u00e4formierten Nucleotide des Serums nahezu quantitativ ausfallen.\nEin weiterer Beweis f\u00fcr die Brauchbarkeit des beschriebenen Verfahrens sind die Resultate, die wir bei Aufarbeitung eines w\u00e4hrend mehrerer Monate autolysierten Eiters erhielten. Hier war zu erwarten, da\u00df durch die Autolyse der Eiterk\u00f6rperchen gr\u00f6\u00dfere Mengen von Nucleotiden entstanden und sich nachweisen lie\u00dfen. Wir fanden in der Tat in diesem Eiter sechsfach gr\u00f6\u00dfere Mengen von Nucleotiden als im Blutserum. Im gleichen Eiter konnten, wie oben mitgeteilt, auch betr\u00e4chtliche Mengen von freien Purinen nachgewiesen werden. In dem autolysierten Eiter fanden wir 27 mg % G.N. (Gesamtpurinstickstoff), 14 mg \u00b0/o P.N. Stickstoff der freien Purine, und demzufolge 13 mg % N.N. (Nucleotidstickstoff). In dem 14 mg \u00b0/0 P.N. war nur 1,1 mg \u00b0/0 Harns\u00e4urestickstoff (berechnet aus 3,3 mg \u00b0/0 kolorimetrisch gefundener Harns\u00e4ure) enthalten1). Diesen abnormen Werten des autolysierten Eiterserums seien die an gesunden Personen ermittelten Normal-werte des Blutserums gegen\u00fcbergestellt:\n') Her Eiter verh\u00e4lt sich wie ein unter Luftabschlu\u00df analysierendes Organ. Es entstehen aus den Kernsubstanzen Nucleotide, die hinwiederum in ihre Bausteine durch die Autolyse zerlegt werden. Da die Autolyse unter Luftabschlu\u00df verlftuft, k\u00f6nnen sich wohl freie Aminopurine, Hypo* renthin und Xanthin, aber fast keine Harnsfiure bilden.","page":319},{"file":"p0320.txt","language":"de","ocr_de":"320 Thannhauaer nnd Czontczer, Experimentelle Studien usw.\n\tStickstoff der freien Purine P.N. */\u2022\tStickstoff der gesamten Purine G.N. 7\u00ab\tNucleotid* Stickstoff N.N. 7\u00ae\tHarn- s\u00e4ure, kolori- metrisch bestimmt 0/ Io\tStickstoff der freien Purine in Harns\u00e4ure umgerechnet (P-N.X3) 7.\tDas Vei hftltnis N.N. : PJ\nH.P. 0< 32 j.\t1,6 mg\t4,77 *)) * q 4,83 }4\u20198mg\t3,2 mg\t1 4,86 mg\t4,80 mg\t3,2:1.6\nF.S. p 40j.\t1,47 mg\t4,70 mg\t3,23 mg\t3,8 mg\t4,41 mg\t3,23:1,4\nJ. L. cf 55 j.\t1,0 mg\t3,05 mg\t2,05 mg\t2,82 mg\t3,0 mg\t2,05 :1,(\nM.K. 28 j.\t1,48 } lM mg\t4,50 mg\t3,06 mg .\ti 4,3 mg\t4,32 mg\t3,06:1,4\nH.W. cf 25 j.\t1,32 mg\t\u2022*,12 . 4,18 )4'15m8\t2,83 mg\t3,90 mg\t3,96 mg\t2,83:1,!\nG. R P 49 j.\tS\u2019}1*-\u00bb\t3,85 mg\t2,62 mg i\t3,55 mg\t3,69 mg\t2,62:1J\nAus diesen Zahlen ersehen wir, da\u00df beim gesunden Menschen ca. 2\u20143 mg Nucleotidstickstoff (N.N.) der Normalwert in 100 ccm Serum ist. Der freie Purinstickstoff (P.N.), normalerweise 1\u20141,5 mg mit 3 multipliziert, ist praktisch gleichbedeutend der im Serum vorhandenen Harns\u00e4uremenge. Der Nucleotidstickstoff ist beim gesunden Individuum ca. 2 mal gr\u00f6\u00dfer als der Stickstoff der freien Purine.\nDie f\u00fcr die Klinik interessierenden Fragestellungen, die sich mit dem beschriebenen Verfahren angehen lassen, wurden bereits von uns bearbeitet und sollen gleichzeitig im \u201eDeutschen Archiv f\u00fcr klinische Medizin\u201c besprochen werden.\n\u2019) Parallel versuche. Die mehrmals ausgef\u00fchrten Parallelversuche haben immer \u00fcbereinstimmende Resultate ergeben.","page":320}],"identifier":"lit20885","issued":"1920","language":"de","pages":"307-320","startpages":"307","title":"Experimentelle Studien \u00fcber den Nucleinstoffwechsel, IX. Mitteilung: \u00dcber den Nachweis und die Bestimmung von gebundenen und freien Purinen im menschlichen Blut- und Eiterserum","type":"Journal Article","volume":"110"},"revision":0,"updated":"2022-01-31T14:59:21.864184+00:00"}