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{"created":"2022-01-31T14:53:08.731063+00:00","id":"lit20905","links":{},"metadata":{"alternative":"Zeitschrift f\u00fcr Physiologische Chemie","contributors":[{"name":"Feulgen, R.","role":"author"}],"detailsRefDisplay":"Zeitschrift f\u00fcr Physiologische Chemie 111: 257-272","fulltext":[{"file":"p0257.txt","language":"de","ocr_de":"Neue Darstellungsmethoden von Nukleins\u00e4uren.\nVon\nR. Feulgen.\n(Aus dem physiologischen Institute der Universit\u00e4t Gie\u00dfen.) (Der Redaktion zugegangen am 3. Augast 1820.)\nBeim experimentellen Studium verschiedener Nukleins\u00e4uren gewann ich den Eindruck, da\u00df die Darstellungsmethoden dieser K\u00f6rper verbesserungsbed\u00fcrftig sind. \u00dcber neue Darstellungsweisen werde ich in dieser und den folgenden Arbeiten derselben \u00dcberschrift berichten.\nI. Mitteilung.\nDie Darstellung der Guanyls\u00e4ure als kristallisierendes\nNatriums alz.\nNukleins\u00e4uren geh\u00f6ren zu den Stoffen, die nur schwer zur Kristallisation gebracht werden k\u00f6nnen. Die komplizierteren Nukleins\u00e4uren - die Thymonukleins\u00e4ure sowie die Hefenukleins\u00e4ure \u2014 sind bisher \u00fcberhaupt noch nicht kristallisiert erhalten worden, und die Guanyls\u00e4ure \u2014 eine der einfachsten \u2014 nur als Brucinsalz.\nDiese Levene1) gelungene Kristallisation der Guanyls\u00e4ure als Brucinsalz bedeutete einen gro\u00dfen Erfolg in der Nukleins\u00e4ure-Chemie; jedoch ist die Darstellung der Brucinsalze \u2014 und auch die Darstellung der rohen Guanyls\u00e4ure nach Levene \u2014 eine sehr umst\u00e4ndliche und bei weiterer Verwendung der Guanyls\u00e4ure, sei es zu chemischen, sei es zu biologischen Versuchen, wird es ohnehin notwendig, das Brucin wieder aus dem Molek\u00fcl zu entfernen*).\n*) Journ. of Biol. Chem. Bd 12(1912).\ns) W\u00e4hrend der Drucklegung dieser Arbeit erfuhr ich durch Referat (C. 1920 III 198), da\u00df auch die freie Guanyls\u00e4ure von Levene kri-Iloppe-Seyler\u2019s Zeitschrift f. physiol. Chemie. CXI.\t19","page":257},{"file":"p0258.txt","language":"de","ocr_de":"258\nR. Feulgen,\nl\nEs gelang mir nun, auch ein Natriumsalz der Guanyls\u00e4ure zur Kristallisation zu bringen, und diesem Umstande lege ich deswegen gr\u00f6\u00dfere Bedeutung bei, weil Natriumsalze ohnehin als Endprodukt bei der von mir beschriebenenl) Guanyls\u00e4ure* * Darstellungsmethode erhalten werden, und weil es so gelang, ohne weiteres zu einem leicht zug\u00e4nglichen kristallisierten End\u00ab Produkte zu kommen, wodurch die Brauchbarkeit der Darstellungsmethode meines Erachtens wesentlich erh\u00f6ht wird.\nDas Wesen der von mir angegebenen Darstellungsmethode ist folgendes :\nIch habe nachgewiesen, da\u00df die Guanyls\u00e4ure in der Pankreasdr\u00fcse nicht als selbst\u00e4ndige Nukleins\u00e4ure vorkommt, sondern mit einer Nukleins\u00e4ure vom Typus der echten gepaart; Guanylnukleins\u00e4ure nannte ich diese Verbindung, \u00fcber die ich bereits fr\u00fcher kurz berichtet habe2). Die Auffindung dieses K\u00f6rpers ist eine strikte Widerlegung der alten Anschauung, da\u00df Guanyls\u00e4ure und Pankreasnukleins\u00e4ure (vom Typus der echten) als getrennte Proteide Vorkommen. Nach diesen Ergebnissen ist die Guanyls\u00e4ure gleichsam nur ein Kunstprodukt, ein abgespaltenes Nukleotid einer h\u00f6heren Nukleins\u00e4ure.\nDiese Anschauungen sind inzwischen von E. Hammarsten8) im wesentlichen best\u00e4tigt worden, der mit anderen Methoden zu demselben Resultate kam, und Meinungsverschiedenheiten bestehen nur in dem molekularen Gewichtsverh\u00e4ltnisse, in dem die beiden Nukleins\u00e4uren gepaart sind. Durch schwache alkalische Hydrolyse wird die Guanylnukleins\u00e4ure leicht gespalten in die Komponenten Guanyls\u00e4ure und Pankreasnukleins\u00e4ure.\nAls Ausgangsmaterial f\u00fcr die Darstellung der im Pankreas vorkommenden Nukleins\u00e4uren w\u00e4hle ich stets das \u00df-Nukleo-proteid, das nach 0. Hammarsten erhalten wird, indem man zerhackte Pankreasdr\u00fcsen auskocht und das Filtrat mit Essig-\nstallisiert erhalten worden ist, und zwar als Guanin-Nukleotid der Hefe-nukleins\u00e4ure, mit dem sie identisch ist (Journ. Biol. Chem. Bd. 41, S. 483\u201493.)\n*) Diese Zeitschr. Bd. 106, S. 249 (1919).\n\u2019) Diese Zeitschr. Bd. 108, S. 147 (1919).\n\u2022) Diese Zeitschr. Bd. 109, S. 141 (1920).","page":258},{"file":"p0259.txt","language":"de","ocr_de":"Neue Darstellungsmethoden von Nukleins\u00e4uren.\n259\ns\u00e4ure f\u00e4llt. H. Steudel fallt obendrein noch mit Alkohol, wodurch die Ausbeuten ganz wesentlich erh\u00f6ht werden. Auch ich benutze zur Darstellung des Ausgangsmaterials die Alkoholf\u00e4llung, und zwar ausschlie\u00dflich diese, da Nukleins\u00e4uren ganz besonders in Gegenwart von Eiwei\u00df eine spezifische F\u00e4llbarkeit mit Alkohol aufweisen. Ob das durch Alkoholf\u00e4llung gewonnene Produkt identisch ist mit dem von 0. Ham mar st eh durch Essigs\u00e4ure dargestellten, ist f\u00fcr mich unerheblich, da ich das Proteid lediglich als Durchgangsk\u00f6rper f\u00fcr die Darstellung der darin vorkommenden Nukleins\u00e4uren benutze.\nDa die Darstellung des Nukleoproteids eine sehr einfache und schnelle ist, und es gelingt, durch einfache Manipulationen die Nukleins\u00e4uren in \u00fcbersichtlichen Verh\u00e4ltnissen und verh\u00e4ltnism\u00e4\u00dfig einfacher Bindung zu erhalten, so empfehle ich stets den Weg \u00fcber das Proteid, zumal es auf diese Weise leicht m\u00f6glich ist, die \u00fcbergro\u00dfe Dr\u00fcsenmasse loszuwerden. Das Proteid ist auch schon deswegen zur Verarbeitung auf die Nukleins\u00e4ure besonders geeignet, weil es sehr reich an Nukleins\u00e4uren ist (\u00fcber 50\u00b0/0 des Proteids bestehen aus Guanylnuklein-s\u00e4ure).\nDie Verarbeitung des Proteids auf Nukleins\u00e4uren mu\u00df nun eine verschiedenartige sein, je nachdem man gr\u00f6\u00dferes Gewicht auf die eine oder die andere Nukleins\u00e4ure legt. Die wissenschaftlich rationellste Verarbeitung w\u00fcrde die sein, da\u00df man aus dem Proteid zun\u00e4chst die Guanylnukleins\u00e4ure darstellt, ein Weg, den ich bereits fr\u00fcher gewiesen habe *), w\u00e4hrend eine genaue Beschreibung der Methode im Rahmen dieser Arbeiten mitgeteilt werden wird. Hat man erst die Guanylnukleins\u00e4ure, so sind durch milde alkalische Hydrolyse auch die Bruchst\u00fccke, n\u00e4mlich die Guanyls\u00e4ure und die Pankreasnukleins\u00e4ure, leicht zug\u00e4nglich, die dann nach der weil er unten beschriebenen Methode getrennt werden k\u00f6nnen. Dieser Weg wird sich aber nicht empfehlen, wenn es wesentlich auf die Guanyls\u00e4ure ankommt, weil die Reindarstellung der Guanylnukleins\u00e4ure mit erheblichen Verlusten verbunden ist, w\u00e4hrend die Guanyls\u00e4ure\n') Biese Zeitschr, Bd. 108, S. 147 (1919).","page":259},{"file":"p0260.txt","language":"de","ocr_de":"260\nR. Fettigen,\nselbst sich mit guter Ausbeute auch durch direkte alkalische Hydrolyse des Proteids gewinnen l\u00e4\u00dft.\nAuf welchem Wege man auch die Guanyls\u00e4ure, um die es sich ja hier handelt, darstellt, immer hat man vor der Isolierungsarbeit eine alkalische Hydrolyse vorzunehmen, da ja die Gunanyls\u00e4ure nicht frei, sondern als Guanylnukleins\u00e4ure vorkommt, und immer mu\u00df man daher auch mit ihrem Begleiter, n\u00e4mlich der Pankreasnukleins\u00e4ure, rechnen. Ich habe nun eine Methode angegeben, mit der eine Trennung der Natriumsalze dieser beiden Nukleins\u00e4uren gelingt, es ist dies die Natriumacetatmethode, die darauf beruht, da\u00df guanyl-saures Natrium in neutraler L\u00f6sung durch Natriumacetat leicht ausgesalzen werden kann, w\u00e4hrend das Natriumsalz der Pankreasnukleins\u00e4ure (und \u00fcbrigens auch der Guanylnukleins\u00e4ure) unter diesen Bedingungen leicht l\u00f6slich ist. So kann man nicht nur eine Trennung der beiden Nukleins\u00e4uren erreichen, sondern auch das guanylsaure Natrium durch .Umscheiden\u201c aus hei\u00dfer Natriumacetatl\u00f6sung einer wirksamen Reinigung unterziehen, wodurch vor allem eine v\u00f6llige Befreiung von Resten der Pankreasnukleins\u00e4ure erzielt werden kann. Aber diese Methode gen\u00fcgt noch nicht zur v\u00f6lligen Reinigung des guanylsauren Natriums. Ich habe n\u00e4mlich gezeigt *), da\u00df das guanylsaure Natrium sehr leicht von basischen Verunreinigungen, die wahrscheinlich aus dem Eiwei\u00df stammen, begleitet ist, wodurch das Pr\u00e4paratmitEssigs\u00e4uref\u00e4llbarundinverd\u00fcnnter Essigs\u00e4ure unl\u00f6slich wird, offenbar durch Bildung eines unl\u00f6slichen Salzes mit dieser Verunreinigung. Hierdurch aber wird die von Ban g angenommene F\u00e4llbarkeit der Guanyls\u00e4ure mit Essigs\u00e4ure vorget\u00e4uscht. Von dieser basischen Verunreinigung l\u00e4\u00dft sich die Guanyls\u00e4ure durch F\u00e4llung mit Alkohol aus alkalischer Reaktion befreien, wobei die basische Verunreinigung durch das starke Alkali von einer Salzbindung mit der Guanyls\u00e4ure abgehalten wird und in der alkoholischen Mutterlauge bleibt. Die Reinigung der Guanyls\u00e4ure durch Alkoholf\u00e4llung aus alkalischer Reaktion ist unbedingt erforderlich und kann auch durch\n*) Diese Zeitscbr. Bd. 106, S. 250 (1919).","page":260},{"file":"p0261.txt","language":"de","ocr_de":"Neue Darstellungsmethoden von Nukleins\u00e4uren.\t261\nein Umscheiden des guanylsauren Natriums aus hei\u00dfer Natriumacetatl\u00f6sung nicht ersetzt werden.\nDiese hier kurz umrissene Darstellungsmethode vermeidet also Schwermetallf\u00e4llungen mit den damit verkn\u00fcpften Unbequemlichkeiten.\nWie fr\u00fchere Analysen zeigten, wies das so gewonnene guanylsaure Natrium bereits einen hohen Grad von Reinheit auf, die durch die nunmehr erfolgende Kristallisation noch erh\u00f6ht wird.\nDas kristallisierte guanylsaure Natrium zeigt jedoch einige Besonderheiten, zu deren Verst\u00e4ndnis die Eigenschaften1) des guanylsauren Natriums herangezogen werden m\u00fcssen.\nDas neutrale sekund\u00e4re guanylsaure Natrium ist in Wa\u00e9ser ziemlich, aber nicht leicht l\u00f6slich, Zusatz von Minerals\u00e4uren bewirkt L\u00f6sung, weil die wasserl\u00f6sliche Guanyls\u00e4ure frei wird. In Essigs\u00e4ure ist das reine und salzfreie guanylsaure Natrium lim Gegensatz zu den Angaben Bangs) nicht unl\u00f6slich, vielmehr quillt in Wasser suspendiertes guanylsaures Natrium auf Zusatz von Essigs\u00e4ure sofort zu einer homogenen sehr hydrophilen Gallerte auf. Durch Alkohol wird die Gallerte als saures guanylsaures Natrium in langen fibrin\u00e4hnlichen Flocken gef\u00e4llt ; auch Natriumacetat bewirkt F\u00e4llung. Versetzt man aber in Wasser suspendiertes neutrales sekund\u00e4res guanylsaures Natrium mit Natronlauge, so tritt leicht v\u00f6llige L\u00f6sung ohne Gallertbildung ein, und aus der alkalischen L\u00f6sung ist mit Natriumacetat keine F\u00e4llung mehr zu erzielen. Dagegen bewirkt Alkohol \u00f6lige F\u00e4llung, die aber bald, besonders beim Reiben, kristallinisch erstarrt.\nAus diesen Erscheinungen ziehe ich den Schlu\u00df,- da\u00df eine Salzbildung mit einem weiteren Molek\u00fcl Natriumhydroxyd stattgefunden hat, da\u00df das so entstandene Salz in Wasser sehr leicht l\u00f6slich und mit Natriumacetat nicht f\u00e4llbar ist. Als Ort f\u00fcr den Eintritt eines weiteren Natriumatoms kommt nurs das Guanin in Frage, da das Natriumsalz der Guanysl\u00e4ure, von dem ich ausgegangen war, ja schon das\n\u2019) Diese Zeitschr. Bd. 106, S. 253 (1919).","page":261},{"file":"p0262.txt","language":"de","ocr_de":"262\nR. Feulgen,\n\u201eneutraleu Salz darstellt, wenigstens soweit die vertretbaren Wasserstoffatome der Phosphors\u00e4ure in Frage kommen. In der Tat kann ja das Guanin auch den Charakter einer S\u00e4ure haben, indem ImidWasserstoffe durch Metalle ersetzt werden k\u00f6nnen, und w\u00e4hrend freies Guanin in Wasser unl\u00f6slich ist. l\u00f6st es sich leicht in starken Alkalien.\nDieses terti\u00e4re Natriumsalz der Guanyls\u00e4ure kann nun leicht zur Kristallisation gebracht werden. Wie erw\u00e4hnt, entsteht auf Zusatz von Alkohol zur alkalischen L\u00f6sung der Guanyls\u00e4ure eine, \u00f6lige Tr\u00fcbung oder sirup\u00f6se F\u00e4llung, die licicli einigem Reiben mit dem Glasstabo zu einer kristallinischen Masse erstarrt. Beim Umkristallisieren in der gleichen Weise eih\u00e4lt man leicht makroskopisch sichtbare flache Prismen, die wie kleine Lineale oder manchmal tafelf\u00f6rmig aussehen. Die Analyse deutet darauf hin, da\u00df im ganzen 3 Na-Atome vorhanden sind, von denen nach dem Gesagten 2 an Phosphors\u00e4ure gebunden sind, w\u00e4hrend das dritte am Guanin sitzt. Schematisch w\u00fcrde der K\u00f6rper also so aussehen :\nNa^\nNa/\nPhosphors\u00e4ure-Ribose-Guanin-Na\nDa die Glukosidbindung im Purinkerne in der Stellung 7 angenommen wird, so kommt f\u00fcr das Na-Atom nur noch die Stellung 1 in Frage.\nAuf Grund dieser Versuche wurde nun die Darstellung\u00bb-weise der Guanyls\u00e4ure auf die Erlangung dieses kristallisierten Endproduktes zugeschnitten, so da\u00df sich nunmehr die unten ausf\u00fchrlich auseinandergesetzte Arbeitsmethode ergibt,\nEigenschaften des terti\u00e4ren guanylsauren Natriums.\nDas terti\u00e4re guanyls\u00e4ure Natrium ist in Wasser \u00e4u\u00dferst leicht l\u00f6slich und im Gegens\u00e4tze zu dem sekund\u00e4ren und prim\u00e4ren Natriumsalze nicht mit Natriumacetat aussalzbar. In anderen L\u00f6sungsmitteln ist es unl\u00f6slich. Da das Guanin eine sehi schwache S\u00e4ure ist, so ist in \"w\u00e4\u00dfriger L\u00f6sung diese Dissoziationsstufe des terti\u00e4ren Salzes weitgehend hydrolytisch dissoziiert, und die L\u00f6sung reagiert deswegen gegen Lackmus","page":262},{"file":"p0263.txt","language":"de","ocr_de":"Neue Darstellungsmethoden von Nukleins\u00e4uren.\t263\nstark alkalisch. Die als S\u00e4ure wirkenden Imidwasserstoffe in dem K\u00f6rper sind nicht nur schw\u00e4cher als die Kohlens\u00e4ure, sondern sogar schw\u00e4cher als der S\u00e4urecharakter des Phenols, denn beide Stoffe verm\u00f6gen das terti\u00e4re Salz in das sekund\u00e4re zu verwandeln. Bei der Darstellung ist daher Kohlens\u00e4ure sorgf\u00e4ltig fernzuhalten. Beim Erhitzen \u00fcber 100\u00b0 br\u00e4unt sich das Salz, verkohlt und verbrennt schlie\u00dflich ohne zu erweichen oder sich aufzubl\u00e4hen und hinterl\u00e4\u00dft eine leicht wei\u00df zu bekommende alkalisch reagierende Asche, die aus Natriumpyro-phosphat und Natriumcarbonat besteht.\nEntstehung und Eigenschaften des terti\u00e4ren guanylsauren\nNatriums dr\u00e4ngen nun zu einem Vergleich mit dem von mir\nfr\u00fcher beschriebenen analogen Salze der Thymonukleins\u00e4ure!).\nAuch das neutral reagierende (quatern\u00e4re) Natriumsalz dieser\nNukleins\u00e4ure verbindet sich in verd\u00fcnnter Natronlauge mit\nweiteren NaOH-Molek\u00fclen, und zwar treten anscheinend 2\nweitere Natriumatome bei der Salzbindung ein. Durch diese\nSalzbildung trat eine Ver\u00e4nderung des Ausgangsmaterials in\nmehrfacher Beziehung ein:\n\u25a0 \u2022\n1.\tGelatinierte (im Falle der a-Form) das Natriumsalz nicht mehr,\n2.\tist von einer optischen Aktivit\u00e4t nichts mehr zu merken, w\u00e4hrend die spezifische Drehung vorher etwa 80\u00b0 betrug.\nDamals hatte ich als mutma\u00dflichen Ort f\u00fcr den Eintritt fier weiteren Na-Atome den kohlenhydrat\u00e4hnlichen Komplex f\u00fcr wahrscheinlich gehalten, haupts\u00e4chlich auch deswegen, weil die Thymins\u00e4ure, die keine Purine mehr enth\u00e4lt, ebenfalls in stark alkalischer Reaktion jede erkennbare Aktivit\u00e4t verliert. Die Analogie mit der Guanyls\u00e4ure veranla\u00dft mich aber, auch bei der echten Nukleins\u00e4ure den Eintritt der weiteren Na-Atome an den Purinen anzunehmen. Es sei hier betont, da\u00df das terti\u00e4re Salz der Guanyls\u00e4ure nicht etwa die beobachtbare Aktivit\u00e4t einb\u00fc\u00dft; denn die freie S\u00e4ure dreht links, und das terti\u00e4re Salz ebenfalls (siehe unten).\n*) Diese Zeitachr. Bd. 104, S. 189 (1919).","page":263},{"file":"p0264.txt","language":"de","ocr_de":"264\nR. Feulgen,\nExperimenteller Teil.\nA. Darstellung des Nukleoproteids.\nDa das Proteid nicht nur als Ausgangsmaterial f\u00fcr die Guanyls\u00e4ure, sondern auch zur Darstellung der Guanylnuklein-\u00df\u00e4ure dient, so soll die Bereitung desselben hier ausf\u00fchrlich besprochen werden, zumal mehrere Punkte im Interesse einer glatten Durchf\u00fchrung der Operationen beachtet werden m\u00fcssen, besonders wenn es sich, wie es zur Durchforschung der Nukleins\u00e4uren notwendig ist, uro die Verarbeitung gr\u00f6\u00dferer Mengen handelt.\na) Allgemeines.\nIm Grunde genommen ist die Darstellung des Proteids sehr einfach: Man kocht die in der Fleischhackmaschine zerkleinerte Dr\u00fcsenmasse mit Wasser aus und f\u00e4llt nach dem Vorschlag von Steudel die Ausz\u00fcge mit Alkohol.\nZun\u00e4chst ist es erforderlich, nur ganz frisch aus dem Schlachthause bezogene Dr\u00fcsen (Pankreasdr\u00fcsen der Rinder) zu benutzen. Da sich diese sehr leicht zersetzen, pflege ich sie nur im Winter bei Frost zu v\u00e8rarbeiten.\nDie Isolierung des Proteids als Trockenpr\u00e4parat w\u00e4re nun aD sich nicht unbedingt erforderlich; denn man k\u00f6nnte ja die w\u00e4\u00dfrigen Extrakte gleich evtl, nach Einengen auf Nukleins\u00e4uren weiterverarbeiten. Da aber neben dem Proteid viele andere Stoffe aus den Dr\u00fcsen ausgelaugt werden, so ziehe ich die Darstellung den Proteids vor.\nDa das Proteid aus der Pankreasdr\u00fcse nicht in reichlicher Menge (etwa 1,5% der Dr\u00fcsenmasse) gewonnen werden kann, anderseits aber verh\u00e4ltnism\u00e4\u00dfig gro\u00dfe Dr\u00fcsenmassen verarbeitet werden m\u00fcssen, so sind gro\u00dfe Fl\u00fcssigkeitsmengen mit geringen Proteidgehalten zu bew\u00e4ltigen, zumal im Interesse einer guten Ausbeute wiederholtes Auskochen erforderlich ist. Die \u00ceYage, ob es vorzuziehen ist, die Extrakte einzuengen oder gleich mit Alkohol zu f\u00e4llen, mu\u00df je nach den Umst\u00e4nden entschieden werden. Im Interesse eines geringen Alkoholverbrauchs ist man geneigt, die Frage im ersteren Sinne zu","page":264},{"file":"p0265.txt","language":"de","ocr_de":"Nene Darstellungsmethoden Ton Nukleins\u00e4uren.\t265\nentscheiden. Ist man aber im Besitze eines gr\u00f6\u00dferen Destillierapparates, so ist es bequemer, die Ausz\u00fcge ohne Einengen mit einer gr\u00f6\u00dferen Menge Alkohol zu f\u00e4llen und dann aus der Mutterlauge den Alkohol zur\u00fcckzugewinnen ; denn ein Abdestillieren der alkoholhaltigen Mutterlauge ist viel einfacher als das Einengen empfindlicher Fl\u00fcssigkeiten in gr\u00f6\u00dferen Mengen. Will man aber die Ausz\u00fcge einengen, was heute im Interesse einer besseren Proteidausbeute wohl zu empfehlen ist, so kann man entweder im Vakuum oder in der Schale auf dem Wasserbade eindampfen. Ersteres ist dann unbedingt geboten, wenn man aus dem Proteid die Guanylnuklein-s\u00e4ure darstellen will; denn diese ist sehr empfindlich. Will man aber auf die Guanyls\u00e4ure hinarbeiten, so gen\u00fcgt auch ein Einengen auf dem Wasserbade in der Schale, besonders wenn man durch Anwendung eines R\u00fchrers und Ventilators f\u00fcr ein schnelles Verdampfen sorgt.\nIm Zusammenh\u00e4nge hiermit ist auch die Frage zu er\u00f6rtern, wie oft und mit wieviel Wasser die Dr\u00fcsen ausgekocht werden sollen. Wendet man zuviel Wasser an, so erh\u00e4lt man das Proteid in den Extrakten verd\u00fcnnter, man mu\u00df dann entsprechend mehr Alkohol aufwenden und trotzdem sinkt die Ausbeute. Dies spielt naturgem\u00e4\u00df keine Rolle, wenn man die Extrakte vor der Alkoholf\u00e4llung einengt. Ich wende meist die direkte Alkoholf\u00e4llung an und koche die Dr\u00fcsen dreimal mit Wasser aus, wobei auf je 15 kg Dr\u00fcsensubstanz 3 1 Wasser kommen. Es sei hier bemerkt, da\u00df es nicht gelingt, alles Proteid aus der zerkleinerten Dr\u00fcsenmasse auszulaugen, was ja bei der histologischen Struktur der Dr\u00fcsenmasse nicht verwunderlich ist. Aus den ausgelaugten Dr\u00fcsen lassen sich noch weitere Mengen Guanyls\u00e4ure gewinnen, wenn man die R\u00fcckst\u00e4nde etwa nach der Neumannschen Nukleins\u00e4uredarstellungsmethode mit Natronlauge verfl\u00fcssigt und nach dem Neutralisieren mit Essigs\u00e4ure mit Alkohol f\u00e4llt. Die Gewinnung und Reindarstellung der so erzielten Guanyls\u00e4ure ergibt sich sinngem\u00e4\u00df aus der unten beschriebenen Darstellungsmethode aus Proteid. Es ist aber ohne weiteres klar, da\u00df man aus den R\u00fcckst\u00e4nden keine Guanylnukleins\u00e4ure mehr","page":265},{"file":"p0266.txt","language":"de","ocr_de":"266\nR. Feulgen.\ngewinnen kann, da diese durch die Alkaliwirkung auch aufgespalten wird.\nDie ausgekochten Dr\u00fcsenmassen lassen sich sehr leicht siedend hei\u00df abfiltrieren, wenn die Dr\u00fcsen vorher einigerma\u00dfen fettfrei pr\u00e4pariert waren. Die Filtrate sind anfangs fast klar; beim Abk\u00fchlen und Stehen entsteht jedoch eine Tr\u00fcbung, zum gr\u00f6\u00dften Teil aus Fett bestehend. Diese Unzutr\u00e4glichkeit wird \u00fcberwunden durch Erzeugung eines Niederschlages in dem Auszuge dadurch, da\u00df einfach mit Natronlauge schwach alkalisch gemacht wird. Der entstehende zarte, flockige Niederschlag (wohl meist Erdphosphate) rei\u00dft alles kolloidal gel\u00f6ste Fett mit und es entsteht eine v\u00f6llig klare Fl\u00fcssigkeit, die man durch Abhebern vom Niederschlage trennt. Die Entfernung der Erdphosphate empfiehlt sich unter allen Umst\u00e4nden, da sie sonst in gro\u00dfer Menge in das Proteid \u00fcbergehen. Nach Neutralisation f\u00e4llt man dann mit Alkohol, evtl, nach vorherigem Einengen. Anderthalb Volumen Alkohol sind wohl meist ausreichend; von zur\u00fcckgewonnenem, nicht 96%igem Alkohol, nimmt man entsprechend mehr. Es ist zu beachten, da\u00df der Niederschlag vor dem Absaugen durch \u00f6fteres Dekantieren mit Alkohol etwas entw\u00e4ssert wird, sonst verschmiert das Filter und die Filtration verl\u00e4uft sehr langsam. Ein v\u00f6lliges Entw\u00e4ssern mit albs. Alkohol und \u00c4ther ist \u00fcberfl\u00fcssig, da es nicht auf die Gewinnung staubfeiner Pulver ankommt und gro\u00dfe Mengen Alkohol dazu notwendig w\u00e4ren. Das Trocknen geschieht am besten durch Aufstreichen auf Glasplatten und Aufbewahren der Platten an einem warmen Oit. Da in den Pr\u00e4paraten immer noch viel Wasser enthalten ist, kleben die Proteidmassen beim Trocknen zusammen und m\u00fcssen nachher zerrieben werden.\nb) Beispiel f\u00fcr die Verarbeitung von 15 kg Dr\u00fcsen.\n15 kg von Bindegewebe, Fett usw. reinpr\u00e4parierte Pankreasdr\u00fcsen vom Rinde (zur Gewinnung dieser Menge sind etwa 20 kg Schlachthaus-Pankreas notwendig) werden mit der Fleischhackmaschine zerkleinert, der Organbrei in einem Kochkessel mit 3 1 siedenden Wassers \u00fcbergossen und unter st\u00e4ndigem Um-","page":266},{"file":"p0267.txt","language":"de","ocr_de":"Neue Darstelluugsmethoden von Nukleins\u00e4uren.\t267\nr\u00fchren mit einem starken Holzstabe weiter erhitzt. Die zuerst sehr dickliche Masse wird gegen 50\u00b0 infolge Koagulation von Eiwei\u00dfk\u00f6rpern d\u00fcnner und weiterhin so d\u00fcnnfl\u00fcssig, da\u00df st\u00e4ndiges Umr\u00fchren nicht mehr notwendig ist. Man erhitzt bis zum Sieden, l\u00e4\u00dft V4 Stunde bedeckt stehen und filtriert auf gro\u00dfen Faltentiltern ab. Nach v\u00f6lligem Abtropfen werden die noch hei\u00dfen Dr\u00fcsenmassen samt anhaftenden Filtern in demselben Kessel abermals mit 3 1 siedenden Wassers durchger\u00fchrt, der dicke Brei unter fortw\u00e4hrendem Umr\u00fchren bis zum Sieden erhitzt, nach V4 Stunde abfiltriert und diese Operation des Auslaugens noch einmal mit 3 1 Wasser wiederholt. Man erh\u00e4lt so ein Gesamtfiltrat von etwa 17 1, f\u00fcr dessen m\u00f6glichst schnelle K\u00fchlung man Sorge tragen mu\u00df, am besten durch ilindurchgie\u00dfen durch einen kupfernen Schlangenk\u00fchler. Der Fl\u00fcssigkeit setzt man zur Vermeidung von F\u00e4ulnis etwas Toluol zu und suspendiert dieses durch Hindurchblasen von Luft durch die Fl\u00fcssigkeit. Nach v\u00f6lligem Abk\u00fchlen versetzt man die Proteidl\u00f6sung mit 338/oiger Natronlauge (10 ccm auf je 1 1), l\u00e4\u00dft den entstehenden Niederschlag \u00fcber Nacht sich absetzen, hebert dann die klare Fl\u00fcssigkeit ab und filtriert vollends den Bodensatz durch ein Faltenfilter ab. Die erzielte klare Fl\u00fcssigkeit wird jetzt mit Eisessig neutralisiert und mit etwa 1 */2 Volumen 96%igem Alkohol versetzt. Beim Bewegen der Fl\u00fcssigkeit mittels Durchblasens von Luft entsteht nach einiger Zeit ein flockiger Niederschlag, von dessen Vollst\u00e4ndigkeit man sich durch weiteren Zusatz von Alkohol \u00fcberzeugt. Man l\u00e4\u00dft ihn ab-sitzen, hebert die Mutterlauge am folgenden Tage ab, entw\u00e4ssert den Niederschlag durch wiederholtes Verr\u00fchren mit Alkohol, Absitzenlassen und Abhebern, saugt endlich ab und trocknet das Proteid nach Aufstreichen auf gro\u00dfe Glasplatten au einem warmen Orte (z. B. \u00fcber einem geheizten Ofen). Ausbeute an lufttrocknem Proteid ca. 200 g = 1,3 \u00b0/o der pr\u00e4parierten Dr\u00fcsen = 1 \u00b0/o der rohen Dr\u00fcsen.","page":267},{"file":"p0268.txt","language":"de","ocr_de":"268\nR. Feulgen,\n\u00df. Darstellung von kristallisiertem guanylsauren Natrium aus Nukleoproteid.\na) Allgemeines.\nDie Darstellung zerf\u00e4llt in folgende vier Phasen:\n1* Alkalische Hydrolyse des Proteids. Hierdurch wird das Eiwei\u00df abgespalten und zugleich die Guanylnukleins\u00e4ure aufgespalten in die Komponenten Guanyls\u00e4ure und Pankreasnukleins\u00e4ure. Durch Alkoholf\u00e4llung aus der neutralisierten und dann mit Ammoniak alkalisch gemachten Hydrolysenfl\u00fcssigkeit gewinnt man ein Gemenge der Natriumsalze dieser beiden Nukleins\u00e4uren.\n2. Reinigung durch Alkoholf\u00e4llung bei mit \u00fcbersch\u00fcssiger Natronlauge alkalisch gemachter Reaktion. Es empfiehlt sich, diese Operation hier, d. h. vor der Trennung der beiden Nukleins\u00e4uren auszuf\u00fchren, weil so beide Nukleins\u00e4uren auf einmal in einer Operation gereinigt werden k\u00f6nnen. Eine Vorbereitung findet diese Operation zweckm\u00e4\u00dfig dadurch, da\u00df tnan schon unter 1. die Rohprodukte der Nukleins\u00e4uren bei alkalischer Reaktion mit Alkohol f\u00e4llt. Es ist aber nicht zweckm\u00e4\u00dfig, schon unter 1. Natronlauge zur alkalischen Reaktion zu verwenden, es liegt ja nahe, hier einfach die alkalische Hydrolysenfl\u00fcssigkeit mit Alkohol zu f\u00e4llen. Vielmehr empfiehlt es sich, bei ammoniakalischer Reaktion zu f\u00e4llen, weil \u00fcbersch\u00fcssige Natronlauge ja mit beiden Nukleins\u00e4uren die alkalisch reagierenden h\u00f6heren Salze bildet, die mit Alkohol schwieriger zu f\u00e4llen sind als die neutral reagierenden. Diese Un Zutr\u00e4glichkeit macht sich besonders in den komplexen L\u00f6sungen der unter 1. entstehenden Hydrolysenfl\u00fcssigkeiten geltend, wird aber vermieden, wenn man bei ammoniakalischer Reaktion f\u00e4llt ; denn Ammoniak ist eine zu schwache Base, um mit den Purinen der Nukleins\u00e4uren die schlecht f\u00e4llbaren h\u00f6heren Salze einzugehen, man bekommt also \u00e4hnlich g\u00fcnstige F\u00e4llungen wie bei neutraler Reaktion, hat aber den Vorzug, bei alkalischer Reaktion arbeiten zu k\u00f6nnen, bei der ja die basischen Zersetzungsprodukte des Eiwei\u00dfes, die bei neutraler F\u00e4llung immer in die Niederschl\u00e4ge","page":268},{"file":"p0269.txt","language":"de","ocr_de":"Nene Darstellungsmethoden von Nukleins\u00e4uren.\n269\nhineingehen, von einer Salzbindung ferngehalten werden, wenn diese Wirkung auch nicht so kr\u00e4ftig ist, als wenn man mit \u00fcbersch\u00fcssiger Natronlauge arbeiten w\u00fcrde.\n3.\tTrennung der Natriumsalze der beiden Nukleins\u00e4uren mittels der Natriumacetatmethode. Dieser Vorgang verlangt neutrale Reaktion, also Bedingungen, unter denen das neutral reagierende sekund\u00e4re guanylsaure Natrium vorliegt\\ denn nur das sekund\u00e4re, nicht das unter 2. erhaltene terti\u00e4re Salz der Guanyls\u00e4ure ist mit Natriumacetat aussalzbar. Es hat also zwischen 2. und 3. eine Neutralisation der L\u00f6sung mit Essigs\u00e4ure stattzufinden.\n4.\tKristallisation des guanylsauren Natriums als terti\u00e4res\nSalz.\nb) Beispiel f\u00fcr die Darstellung.\n1. Hydrolyse.\n100 g Proteid werden mit 2 1 siedenden Wassers \u00fcbergossen, die L\u00f6sung auf \u00fcber 90\u00b0 gebracht, 100 ccm 33%ige Natronlauge zugef\u00fcgt und dann der Kolben sofort in ein siedendes Wasserbad versenkt. Nach 30 Minuten k\u00fchlt man unter der Wasserleitung schnell auf etwa 50\u00b0 ab, neutralisiert das Filtrat genau mit Eisessig und dampft im Vakuum (oder auch in der Schale) auf ungef\u00e4hr 200 bis 300 ccm ein. Findet das Einengen bei niederer Temperatur im Vakuum statt, so scheidet sich bald das sekund\u00e4re guanylsaure Natrium als feinflockiger Niederschlag ab. Die eingeengte Fl\u00fcssigkeit versetzt man mit 30 ccm konz. Ammoniak, verd\u00fcnnt mit Wasser bis zu einem Volumen von 400 ccm, erw\u00e4rmt, bis das abgeschiedene sekund\u00e4re guanylsaure Natrium wieder gel\u00f6st ist, und f\u00e4llt mit 2 Volumen 96%igem Alkohol. Die sich flockig abscheidenden Natriumsalze der beiden Nukleins\u00e4uren l\u00e4\u00dft man mehrere Stunden absitzen, entw\u00e4ssert den Niederschlag durch \u00f6fteres Dekantieren mit Alkohol, saugt ab und trocknet. Ausbeute an gemischten Nukleins\u00e4uren 43 g = 43 % ' des Proteids.","page":269},{"file":"p0270.txt","language":"de","ocr_de":"270\nR. Feulgen,\n2. Reinigung des Rohproduktes durch Alkoholf\u00e4llung hei alkalischer Reaktion.\nDas Rohprodukt (43 g) wird mit etwa der 4 fachen Menge (160 ccm) Wasser hei\u00df gel\u00f6st, mit 33%iger Natron-lauge (auf 100 ccm zur L\u00f6sung benutzten Wassers 10 ccm> stark alkalisch gemacht und die visk\u00f6se L\u00f6sung durch ein Faltenfilter filtriert. Die Filtration geht langsam vonstatten, pflegt aber \u00fcber Nacht beendet zu sein. Im Filtrate l\u00f6st man (zur besseren Ausflockung mit Alkohol) 16 g kristallisiertes essigsaures Natrium auf und f\u00e4llt mit Alkohol (3 f\u00e2ches Volumen des angewandten Wassers). Die F\u00e4llung nimmt man in einem Kolben vor, den man \u00fcber Nacht auf einem Strohkranz schr\u00e4g hinstellt. In dieser Zeit haben sich die \u00f6lig ausgefallenen h\u00f6heren Natriumsalze der Nukleins\u00e4uren abgesetzt und man kann die Mutterlauge abgie\u00dfen. Den weichen R\u00fcckstand l\u00f6st man jetzt in 100 ccm Wasser, f\u00fcgt 10 ccm 33 % ige Natronlauge hinzu, l\u00f6st in der Fl\u00fcssigkeit 10 g Natriumacetat und f\u00e4llt abermals mit Alkohol (300 ccm). Nach abermaligem Absitzen l\u00f6st man den R\u00fcckstand in 100 ccm Wasser und neutralisiert mit Eisessig, worauf infolge gebildeten Natriumacetats das sekund\u00e4re guanylsaure Natrium bereits ausf\u00e4llt.\n3. irennung der beiden Nukleins\u00e4uren.\nZur v\u00f6lligen Abscheidung des sekund\u00e4ren guanylsauren Natriums l\u00f6st man in der Fl\u00fcssigkeit noch 10 g Natriumacetat auf, l\u00e4\u00dft in der K\u00e4lte mehrere Stunden stehen und zentrifugiert das guanylsaure Natrium ab. Dieses l\u00f6st man jetzt am besten gleich in den Zentrifugengl\u00e4sern in 100 ccm siedend hei\u00dfer 20 /oiger Natriumacetatl\u00f6sung und zentrifugiert wiederum nach mehrst\u00fcndigem Stehen in der K\u00e4lte. Die abzentrifugierten klaren L\u00f6sungen enthalten das Natriumsalz der Pankreasnukleins\u00e4ure, das durch F\u00e4llen mit dem 3 fachen Volumen Alkohol als Rohprodukt gewonnen werden kann. \u00dcber seine Reindarstellung werde ich sp\u00e4ter berichten. Das abzentrifugierte guanylsaure Natrium wird nunmehr zur v\u00f6lligen Be-","page":270},{"file":"p0271.txt","language":"de","ocr_de":"Neue Darstellungsmethoden von Nukleins\u00e4uren.\n271\nfreiung von der Pankreasnukleins\u00e4ure noch 5 mal aus je 50 ccm 20 /o iger Natriumacetatl\u00f6sung aus Siedehitze umgeschieden und endlich mit Alkohol entw\u00e4ssert und getrocknet. Ausbeute an reinem (noch etwas Natriumacetat enthaltendem) sekund\u00e4ren guanylsaurem Natrium 10 g = 10% des Proteids.\n4. Kristallisation des terti\u00e4ren Salzes.\n10 g sekund\u00e4res guanylsaures Natrium werden in 100 ccm n-NaOH gel\u00f6st und das Filtrat mit 400 ccm 96%igem Alkohol versetzt. Es entsteht ein sirup\u00f6ser Niederschlag, der beim Keiben bald kristallinisch erh\u00e4rtet. Wenn das Pr\u00e4parat nicht mehr schmiert, l\u00e4\u00dft man noch einige Stunden stehen, saugt den K\u00f6rper ab und w\u00e4scht mit Alkohol nach. Getrocknet wird \u00fcber Chlorkalzium oder reiner konz. Schwefels\u00e4ure, aufbewahrt \u00fcber Natronkalk oder dergl. Zum Umkristallisieren l\u00f6st man das Salz in der 5 fachen Menge kalten Wassers, versetzt mit Alkohol (4 f\u00e2ches Volumen des angewandten Wassers) und l\u00e4\u00dft ruhig stehen. Es entsteht eine kolloidale Tr\u00fcbung, die nach einiger Zeit zu einem lockeren Kristallbrei erstarrt. Weitere Behandlung wie vorhin. Ausbeute an terti\u00e4rem guanylsauren Natrium etwa 10 g = 10% des angewandten Proteids.\nZur Analyse wurde die Substanz \u00fcber Phosphorpentoxyd bei 95\u00b0 im Vakuum getrocknet. Eine C- und H-Bestimmung konnte aus \u00e4u\u00dferen Gr\u00fcnden nicht vorgenommen werden; da es sich bei dem vorliegenden K\u00f6rper im wesentlichen um ein anderes Salz einer bereits fr\u00fcher von mir analytisch identifizierten S\u00e4ure handelt, konnte auch darauf verzichtet werden. Aufschlu\u00df \u00fcber die Natur des Salzes gibt uns vor allem die Na-Bestimmung. Hierzu wurde die Substanz verascht, die Asche in Wasser gel\u00f6st, durch Erw\u00e4rmen mit einem \u00dcberschu\u00df von Schwefels\u00e4ure die Pyrophosphors\u00e4ure in Ortho-phosphors\u00e4ure verwandelt; durch Baryt die S\u00e4uren entfernt, und nach der Beseitigung des \u00fcbersch\u00fcssigen Baryts mittels Schwefels\u00e4ure das Natrium in der \u00fcblichen Weise als Natriumsulfat gewogen.","page":271},{"file":"p0272.txt","language":"de","ocr_de":"272 R. Fe ul gen, Neue Darstellungsmethoden ron Nukleins\u00e4uren.\n0,1527 g entsprachen 17,5 ccm n/,\u201e-S\u00e4ure (Kjeldahl), 0,1639 g ,\t18,8 ccm n/,\u201e-S\u00e4ure\t\u201e\n0,1749 g\t*\t22,1 ccm n/s-Lauge (Neumann),\n0,1399 g\t\u201e\t17,4 ccm n/j-Lauge ,\n0,4119 g lieferten 0,2079 g Na,S04.\n\tBerechnet f\u00fcr CioHuO,N5PN\u00ab,\tGefunden:\nN\t16,32\t16,06; 16,10\nP\t7,23\t7,01; 6,90\nNa\t\u2022 16,08\t16,34\nDie Analyse deutete auf einen etwas zu hohen Aschengehalt hin, weswegen die Substanz noch einige Male umkristallisiert wurde:\ni\n0,3400 g lieferten 0,1645 g NajS04.\n\tBerechnet f\u00fcr Cl\u201eH110,NsPNaJ\tGefunden :\nNa\t16,08\t15,70\nPolarimetrische Verh\u00e4ltnisse:\nc = 9,067; 1 = 1; \u00ab = \u20149,83\u00b0; t = 22\u00b0; [a]^' = -38,3*.\nBei dieser Arbeit wurde ich von Herrn M. Behrens unterst\u00fctzt, wof\u00fcr ich ihm bestens danke.","page":272}],"identifier":"lit20905","issued":"1920","language":"de","pages":"257-272","startpages":"257","title":"Neue Darstellungsmethoden von Nukleins\u00e4uren","type":"Journal Article","volume":"111"},"revision":0,"updated":"2022-01-31T14:53:08.731069+00:00"}