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{"created":"2022-01-31T16:45:43.288911+00:00","id":"lit37431","links":{},"metadata":{"alternative":"Zeitschrift f\u00fcr Physiologische Chemie","contributors":[{"name":"Lippich, F.","role":"author"}],"detailsRefDisplay":"Zeitschrift f\u00fcr Physiologische Chemie 90: 145-157","fulltext":[{"file":"p0145.txt","language":"de","ocr_de":"Ober die Isolierung von Leucin und anderen Aminos\u00e4uren aus\nK\u00f6rperfl\u00fcssigkeiten.\n\u2022\tVon\t*\nPriv.-Doz. Dr. F. Lippich. '\u2022 \u2018\n(Aus dem medizinisch-chemischen Institute der Prager deutschen Universit\u00e4t.)\n(Der Redaktion zugegangen am 20. Februar 1911.)\nTrotz einer Reihe von Methoden und trotz einer reichen Literatur \u00fcber den Gegenstand geh\u00f6rt die Isolierung von Aminos\u00e4uren aus K\u00f6rperfl\u00fcssigkeiten und deren sichere Identifizierung noch keineswegs zu den leichten Aufgaben. Ja selbst der Nachweis des Tyrosins ist nicht immer ganz einfach zu f\u00fchren. Denn ganz abgesehen von der Empfindlichkeit, die bei jenen Methoden nur gering sein kann, mu\u00df zur sicheren Identifizierung die Aminos\u00e4ure aus dem Derivat, in welches sie zur Isolierung \u00fcbergef\u00fchrt wurde, wieder regeneriert und dann meist ihrerseits noch weiteren Reinigimgsprozeduren unterworfen werden. Dies gilt auch f\u00fcr den Fall, den ich hier im Auge habe, da\u00df n\u00f9r eine oder. zwei Aminos\u00e4uren zugegen sind. Nun besitzen wir in den \u00dcrainidos\u00e4urereakti\u00f6nen ein Mittel* die Aminos\u00e4uren in Derivate \u00fcberzuf\u00fchren, deren Molek\u00fcl nur wenig gr\u00f6\u00dfer ist, als jenes der Ausgangsk\u00f6rper, was f\u00fcr die Elementaranalyse von Bedeutung ist, und die ferner meist so ausgesprochene analytische/ Eigenschaften aufweisen, da\u00df zur sicheren Identifizierung die Aminos\u00e4ure gar nicht regeneriert zu werden braucht, d. h. da\u00df also mit der Charakterisierung jenes Derivates auch die zugeh\u00f6rige Aminos\u00e4ure eindeutig bestimmt ist. Es mag bei dieser Gelegenheit neuerdings hervorgehoben werden, da\u00df schon das Zustandekommen der Uramidos\u00e4urebildung unter den von mir angegebenen Bedingungen f\u00fcr sich allein so charakteristisch ist, da\u00df, wenigstens soweit physiologische Verh\u00e4ltnisse in Frage\nHoppe-Seyler\u2019s Zeitschrift fi physiol. Chemie. XC.\t10","page":145},{"file":"p0146.txt","language":"de","ocr_de":"146\tF. Lippich,\nkommen, der positive Ausfall der Reaktion allein\u2019 das Vorhandensein der einen oder anderen Aminos\u00e4ure mit einer Sicherheit anzeigt, die hinter jener, von allgemein verwendeten Reaktionen auf andere physiologische Substanzen, nicht zu-\u2022 r\u00fccksteht.\nIn der vorhergehenden Abhandlung wurde gezeigt, da\u00df dies besonders f\u00fcr den Nachweis von Leucin gilt, jedoch wurde dort vorausgesetzt, da\u00df das Leucin wenigstens bis zu einem gewissen Grade isoliert vorliegt. F\u00fcr K\u00f6rperfl\u00fcssigkeiten ist es nun wichtig zu entscheiden, ob und wieweit die Reaktion ohne vorhergehende Isolierung der Aminos\u00e4ure (von der selbstverst\u00e4ndlichen Entfernung von Eiwei\u00df usw. abgesehen) verwendbar ist, weil es ja doch haupts\u00e4chlich darauf ankommt, die Empfindlichkeit des Nachweises m\u00f6glichst zu steigern. Gelingt einmal der Nachweis m\u00f6glichst kleiner Mengen, dann ergibt sich die Isolierung gr\u00f6\u00dferer Mengen und bei der leichten Reindarstellung speziell der Leucinurs\u00e4ure die Identifizierung der Aminos\u00e4ure ohne Schwierigkeit. Von diesem Gesichtspunkte aus wurden die zun\u00e4chst mitzuteilenden Versuche unternommen. In erster Linie war nat\u00fcrlich der Harn zu ber\u00fccksichtigen. Handelt es sich um sehr kleine Aminos\u00e4uremengen, so ist \u2014 von pathologischen Substanzen sei inzwischen abgesehen \u2014 zun\u00e4chst an den im Verh\u00e4ltnis zur Aminos\u00e4ure enormen Harnstoff\u00fcberschu\u00df zu denken. Es m\u00f6chte wohl scheinen, da\u00df es vorteilhafter w\u00e4re, durch einfaches Kochen des Harns die- \u00dcberf\u00fchrung in die Uramidos\u00e4ure herbeizuf\u00fchren. Da ef sich aber um den Nachweis von Leucin dreht, f\u00fcr welches speziell die Abscheidung der freien Uraminos\u00e4ure charakteristisch und am empfindlichsten ist, so mu\u00df man trachten, letztere resp. ihr Salz in m\u00f6glichst konzentrierter Losung, welche tunlichst geringe Mengen besonders von krvstallisationshemmenden Substanzen f\u00fchrt, zu erhalten. Nun ist, wie ich schon mitgeteilt habe, gerade ein gro\u00dfer Harnstoff\u00fcberschu\u00df geeignet, die Krystallisation der Uramidos\u00e4ure stark zu hemmen. Selbst bei vielst\u00fcndigem Kochen des Harnes w\u00fcrde nur ein kleiner Teil des vorhandenen Harnstoffes zerst\u00f6rt werden. Anderseits war bei Versuchen, den","page":146},{"file":"p0147.txt","language":"de","ocr_de":"Isolierung von Leucin und Aminos\u00e4uren aus K\u00f6rperfl\u00fcssigkeiten. 147 Harnstoff\u00fcberschu\u00df zu entfernen, ein Verlust an Aminos\u00e4ure\nzu bef\u00fcrchten, was, cty es sich ja um den Nachweis kleiner Mengen handeln sollte, nicht \u00fcbersehen werden durfte Es erschien also am zweckm\u00e4\u00dfigsten, die Aminos\u00e4ure gleichzeitig mit dem Harnstoff herauszuholen und dann erst die erstere von dem letzteren zu trennen. Hierzu wurde eimsehr elegantes Verfahren verwendet, welches hier mitgeteilt sei, weil es vielleicht anderweitig gute Dienste leisten kann. 5 mg Leucin und 3 g Harnstoff wurden in einem mit eingeriebenem R\u00fcckflu\u00dfk\u00fchler versehenen K\u00f6lbchen mit einem \u00dcberschu\u00df von\nAmylalkohol durch 12 Stunden gekocht. Dabei Wird der Harn* stoff quantitativ in Amylurethan \u00fcbergef\u00fchrt, welch\u00e9s leicht durch \u00c4ther entfernt werden kann ; wird durch das Kochen mit Amylalkohol die Aminos\u00e4ure nicht alteriert, so mu\u00df sie nach Entfernung des Urethans wiedergefunden werden, ln der Tat wurde nach Abdampfen des \u00fcbersch\u00fcssigen Amylalkohols am Wasserbade und nach Entfernung des Urethans mit \u00c4ther ein R\u00fcckstand erhalten, der in jener* in der vorhergehenden Abhandlung beschriebenen Weise auf Leucin gepr\u00fcft, einen positiven Ausfall der Reaktion gab. Auf den Harn wurde die Reaktion in der Weise angewendet, da\u00df der im Vakuum gewonnene Abdampfr\u00fcckstand von 100\u2014200 ccm eines Harnes mit 0,005 \u00b0/o* Leucin, mit ammoniakalischem Alkohol extrahiert wurde in der Voraussetzung, hierdurch gleich-\nzeitig auch das Leucin zu gewinnen. Der R\u00fcckstand Vom ammoniakalischen Alkohol wurde im Vakuum \u00fcber Schwefel-\ns\u00e4ure getrocknet und sodann in der oben angegebenen Weise mit \u00fcbersch\u00fcssigem Amylalkohol gekocht. Leider wurde trotz mehrfacher Wiederholung mit jedesmaligen Modifikationen, schlie\u00dflich ein positives Resultat picht erhalten, vermutlich infolge der braunen harzigen Substanzen, die 'beim Kochen der Harnextrakte mit Amylalkohol sich bilden.\nDieser Versuch, durch m\u00f6glichste Isolierung des Le\u00fccins zum Ziele zu gelangen, war somit zun\u00e4chst fehlgeschlagen. Es wurde daher nunmehr getrachtet, den Nachweis direkt, ohne vorhergehende Isolierung zu f\u00fchren. Es war dabei von vornherein klar, da\u00df dies nur mit einer gewissen Einbu\u00dfe an","page":147},{"file":"p0148.txt","language":"de","ocr_de":"Iw\tF. Lippich,\nEmpfindlichkeit gelingen konnte. Nach einer Reihe von Vorversuchen erwies sich das folgende einfache Verfahren am zweckm\u00e4\u00dfigsten : 100 ccm Leucinharn werden in einem nicht zu kleinen offenen Kolben \u00fcber freier Flammfe eingekocht (auf etwa ll3 Vol); hierauf wird etwa das gleiche Volum kalt ges\u00e4ttigten Barytwassers zugef\u00fcgt und die Fl\u00fcssigkeit 3 \u2014 4 Stunden im Sieden erhalten. Nimmt w\u00e4hrend des Kochens die Ammoniakentwicklung ab, so mu\u00df, falls der Ersatz der weggekochten Fl\u00fcssigkeit durch Barytwasser dieselbe nicht wieder steigert, etwas Harnstoff zugef\u00fcgt werden. In die hei\u00dfe Fl\u00fcssigkeit wird sofort Kohlens\u00e4ure eingeleitet, und das Filtrat vom kohlensauren Baryt mit etwas Tierkohle unter Kochen entf\u00e4rbt; hierauf dampft man am Wasserbade ein, wobei sich die Fl\u00fcssigkeit meist wieder etwas gelb f\u00e4rbt, filtriert, wenn n\u00f6tig, die auf wenige Kubikzentimeter (3\u20144) eingeengte Fl\u00fcssigkeit, oder die L\u00f6sung des mit m\u00f6glichst wenig Wasser aufgenommenen R\u00fcckstandes durch ein kleines Filterchen in eine Eprouvette und s\u00e4uert nun vorsichtig mit Salzs\u00e4ure an; entsteht der Niederschlag, d. h. die charakteristische Ausscheidung von nadelf\u00f6rmigen Krystallen nicht alsbald, so impft man und sch\u00fcttelt h\u00e4ufig und anhaltend; die Reaktion ist erst dann als negativ zu betrachten, wenn auch nach h\u00e4ufigem Sch\u00fctteln und 12st\u00fcndigem Stehen keine Krystallisation erfolgt ist; unter Umst\u00e4nden werden nach dieser Zeit besonders sch\u00f6ne Krystalle erhalten. Die Krystalle sind wenig gef\u00e4rbt; undeutliche und dann meist gef\u00e4rbte krystallinische Ausscheidungen sind nicht beweisend.\nDie kleinste auf diesem Wege noch nachweisbare Menge zugesetzten Leucins betr\u00e4gt 0,01 g in 100 ccm Harn; doch mu\u00df in diesem Falle die Reaktion mit einer gewissen \u00dcbung und Erfahrung resp. Vorsicht ausgef\u00fchrt werden ; unter allen Umst\u00e4nden gelingt die Reaktion und zwar fast immer mit unzweifelhaftem, starkem Ausfall, bei- einem Gehalt des Harnes von 0,015\u20140,02 g Leucin auf 100 ccm. Wie man sieht, erweist sich zum Nachweise des Leucins in Form der freien Uramido-s\u00e4ure die Verwendung von Barytwasser am vorteilhaftesten. Durch das mehrst\u00fcndige Kochen mit demselben wird ein er-","page":148},{"file":"p0149.txt","language":"de","ocr_de":"Isolierung von Leucin und Aminos\u00e4uren \u00e0us K\u00f4rperfl\u00fcssigkeit\u00e7n. 119\nheblicher Teil des \u00fcberfl\u00fcssigen und sp\u00e4ter st\u00f6renden Harn-Stoffes zersetzt, doch ist zu beachten, da\u00df immer ein gewisser Harnstoff\u00fcberschu\u00df vorhanden sein mu\u00df, damit nicht schon gebildete Uramidos\u00e4ure wieder zerlegt wird. Auch im Sinne der Entfernung anderer Harnbestandteile, wie eines Teiles der f\u00e4rbenden Substanzen, der Zerlegung gewisser normalerweise vorhandener K\u00f6rper, wie der Hippurs\u00e4ure usw., ist das Barytw\u00e4sser zweckm\u00e4\u00dfig. Wird durch dasselbe auch eine Herab-setzung der Empfindlichkeit bedingt, so ist diese im Vergleich zu der im Harn ohne vorherige Isolierung des Leucins voraus-sichtlich \u00fcberhaupt zu erreichende Empfindlichkeit gewi\u00df nicht sehr gro\u00df und f\u00e4llt schon garnicht ins Gewicht, Wenn man diese Reaktion mit den f\u00fcr den Nachweis von Leucin im Harn verf\u00fcgbaren Methoden vergleicht. Die \u00dcberlegenheit auch in anderer Beziehung der hier mitgeteilten Methode , kennzeichnet sich wohl am besten durch den Hinweis, da\u00df hier eine Reaktion vorliegt, die kleine Mengen eines K\u00f6rpers, der sonst nur- bei gr\u00f6\u00dferen Quantit\u00e4ten und auch da nur schwierig nachzuweisen ist, mit einer Einfachheit und Sicherheit na\u00e7hzuweis\u00e9n gestattet, die an jene des Harnstoff- oder Harnsuurenachweis\u00e8s heranreichL Die normalerweise vorkommenden Harnbestandteile k\u00f6nnen wohl zu ernstlichen Verwechslungen keine Veranlassung geben, wenigstens was den Fleischfresserharn anlangt ; aber auch in pathologischen Harnen sind bei entsprechender Vorsicht Verwechslungen kaum m\u00f6glich, zum mindesten wird schon eine Behandlung der erhaltenen Krystallisation mit \u00c4ther, voraus-gesetzt, da\u00df es sieh um gut ausgebildete Krystalle handelt (vgl. das bei Beschreibung der Reaktion Gesagte), in den allermeisten F\u00e4llen vor Verwechslungen sch\u00fctzen. Es w\u00fcrde zu weit r\u00fchren, hier auf alle M\u00f6glichkeiten des genaueren einzugeheji, es d\u00fcrfte wohl die Tatsache gen\u00fcgen, da\u00df im normalen Menschenharn wenigstens die Reaktion ohne Zusatz von Leucin niemals positiv ansf\u00e4llt, auch nicht andeutungsweise Es erledigt sich damit auch der eventuelle Einwand, da\u00df durch das Kochen mit Barytwasser Leucin aus eiwei\u00dfartigen Harnbestandteilen abgespalten werden k\u00f6nnte. Aber auch in einer ganzen Reihe pathologischer Harne, die ich untersuchte, gelang es mir niemals.","page":149},{"file":"p0150.txt","language":"de","ocr_de":"1\u00d4\u00d4\tF. Lippich,\neine positive Reaktion zu erhalten. Es befanden sich darunter Harne nach Phosphorvergiftungen in verschiedenen Stadien des Verlaufes, Harne von Leuk\u00e4mischen, von Pneumonief\u00e4llen im Stadium der Lysis, von Tuberkul\u00f6sen, ikterische Harne, Harne bei Neubildungen usw. Wurde solchen pathologischen Harnen auf 100 ccm 0,02 g Leucin zugesetzt, so fiel die Reaktion positiv aus.\nK\u00f6nnen die normalen Harnbestandteile auch keinen Anla\u00df zu Verwechslungen abgeben, so ist die M\u00f6glichkeit nicht von der Hand zu weisen, da\u00df sie in anderer Art die Reaktion st\u00f6ren, indem sie insbesondere, soweit sie NH8-Gruppen tragen, mit Leucin reagieren. Da\u00df dies bei Zimmertemperatur nicht der Fall ist, zeigt der Umstand, da\u00df konservierte, \u00fcber ein Jahr alte k\u00fcnstliche Leucinharne die Reaktion in derselben Weise gaben wie eben frisch bereitete. Aber auch bei Siedehitze und besonders bei Gegenwart von Barytwasser ist f\u00fcr den Harn speziell eine Wirkung in der angedeuteten Richtung wenig wahrscheinlich, weil jene Substanzen gegen\u00fcber dem so leicht reagierenden Harnstoff in ganz untergeordneter Menge vorhanden sind und weil sie au\u00dferdem durch kochendes Alkali leicht zersetzt werden. Nichtsdestoweniger wurde eine Reihe von Versuchen in dem genannten Sinne ausgef\u00fchrt. Leucin wurde mit je der doppelten Gewichtsmenge von Hippurs\u00e4ure, Kreatinin, Harns\u00e4ure und Allantoin in Barytwasser gekocht. Nach c\u00e4. 6 Stunden wurde der Versuch unterbrochen und die vom \u00fcbersch\u00fcssigen Baryt durch Kohlens\u00e4ure befreite Fl\u00fcssigkeit im Vakuum verdunstet. Wie zu erwarten, lie\u00df sich in den ersten drei F\u00e4llen eine im merklichen Ma\u00dfe eingetretene Reaktion nicht nachweisen, nur das Allantoin schien in irgend einer Form eingewirkt zu haben, doch lie\u00df die geringe Menge des vermeintlichen Reaktionsproduktes weitere Schl\u00fcsse nicht zu. Da Allantoin f\u00fcr den Menschenharn nicht in Betracht kommt, so wurden diese Untersuchungen zun\u00e4chst auf einen gelegeneren Zeitpunkt verschoben. Um Leucinurs\u00e4ure, die infolge des bei der alkalischen Spaltung des Allantoins entstehenden Harnstoffes gebildet worden sein konnte, handelte es sich nicht.\nWas die St\u00f6rung der Reaktion durch pathologische Sub-","page":150},{"file":"p0151.txt","language":"de","ocr_de":"Isolierung von Leucin und Aminos\u00e4uren aus K\u00f6rperfl\u00fcssigkeiten. 151\n' \u2022\t* \u2022 \u25a0 \u2022_\tV..\nstanzen wie Eiwei\u00df. Zucker usw. anlangt, so seien folgende Erfahrungen mitgeteilt. Was das Eiwei\u00df betrifft, so brauchte dasselbe kaum besonders angef\u00fchrt zu werden, weil man es auf jeden Fall vor Anstellung der Reaktion durch Koagulation entfernen wird. Doch da der Harn unter Umst\u00e4nden nicht hitzekoagulable Eiwei\u00dfk\u00f6rper in gr\u00f6\u00dferer Menge enthalten kann, so schien es nicht nutzlos, auch den Einflu\u00df von gegenw\u00e4rtigem Eiwei\u00df zu pr\u00fcfen. Von einem Harn, welcher 6,02 \u00b0/o Leucin und 0,2 \u00b0/o Eiwei\u00df enthielt, wurden 100 ccm in der \u00fcblichen Weise mit Barytwasser, diesmal unter Zuf\u00fcgung von etwas Harnstoff, gekocht ; der im Momente des Aufkochens entstehende flockige Niederschlag wurde zun\u00e4chst nicht abfiltriert ; die Weiterbehandlung der Proben in der beschriebenen Weise gab negative Resultate, ob die Kochdauer mit Barytwasser 4, 6 oder 8 Stunden betrug. Wurde der im Momente des Aufkochens entstehende Niederschlag abfiltriert und sodann das Kochen fortgesetzt, so wurde eine normale positive Reaktion erhalten. Nebenbei zeigen die Versuche, da\u00df bei der angewendeten Kochdauer Leucin in irgend erheblicher Menge durch das Barytwasser nicht abgespalten wird, wenngleich das Eiwei\u00df gewi\u00df eine Hemmung der Reaktion vermutlich in bezug auf die Krystal-lisation setzt. Wurde dem gleichen Leucinharn auf 100 ccm 0,2 g Witte-Pepton zugesetzt, so wurde nach 6st\u00e4ndiger Koch-dauer unter sonst gleichen Verh\u00e4ltnissen eine negative Reaktion erhalten ; dagegen fiel die Reaktion in normaler Weise positiv aus, wenn der Gehalt un Pepton 0,05 g in 100 ccm Harn betrug. Desgleichen wirken gr\u00f6\u00dfere Mengen Traubenzucker, offenbar auch durch Verhinderung der Krystallisation hemmend ; die Reaktion fiel negativ aus, wenn dem Leucinharn auf 100 ccm 5\u2014l g Traubenzucker zugesetzt wurden, wohl aber trat eine, wenn auch langsam entstehende Krystailisation auf, wenn der Gehalt an Traubenzucker 0.5 \u00b0/o betrug. Gallens\u00e4uren in einer Menge, wie sie im Ham wohl kaum m\u00f6glich ist, hindern die Reaktion infolge der harzigen Ausscheidung der Chols\u00e4ure, welche beim Ans\u00e4uren mit Salzs\u00e4ure entsteht; dagegen tritt die Reaktion bei einem G\u00e8halt von 0,05 g Chols\u00e4ure in iOO ccm in normaler Weise positiv ein.","page":151},{"file":"p0152.txt","language":"de","ocr_de":"^2\tF. Lippich,\nDer Vollst\u00e4ndigkeit halber sei endlich noch der M\u00f6glichkeit gedacht, da\u00df im Harn statt Leucin noch andere Amido-s\u00e4uren a\u00fcftreten k\u00f6nnen. Von diesen k\u00f6nnten Phenylalanin und eventuell noch Valin eine positive Reaktion Vort\u00e4uschen. Gegen eme eventuelle Verwechslung mit Phenylalanin kann man sich wohl dadurch sch\u00fctzen, da\u00df man die erhaltene Krystallisation, wenn sie nicht allzu sp\u00e4rlich ist, abfiltriert, und in bekannter Weise mit Kaliumbichromat und Schwefels\u00e4ure pr\u00fcft ; auch die Uramidos\u00e4ure gibt den Geruch nach Phenylacetaldehyd Im allgemeinen m\u00fc\u00dfte man jedoch trachten, durchVerarbeitung einer gr\u00f6\u00dferen Menge Harn gen\u00fcgendes Material zu einer Schmelzpunktsbestimmung uswv zu gewinnen. F\u00fcr Leucin w\u00fcrde, besonders wenn der Prozentgehalt h\u00f6her ist als der bisher angenommene, die hier mitgeteilte Methode sehr rasch und einfach zum Ziele f\u00fchren, zur Isolierung anderer Aminos\u00e4uren aber\nw\u00fcrde sie wenig zweckdienlich sein; hier ist nun mit gr\u00f6\u00dftem\nVorteile die Anhydridmethode zu verwenden.\nMittels derselben k\u00f6nnen, so weit die Erfahrungen reichen, Alanin, Valin, Leucin (nat\u00fcrlich auch falls sie Vorkommen w\u00fcrde, Aminobutters\u00e4ure), ferner Phenylalanin und Tyrosin, in Form ihrer Hydantoine isoliert und nachgewiesen werden.\nDie Ausf\u00fchrung ist wieder eine sehr einfache. Die \u00dcberf\u00fchrung in die Uramidos\u00e4ure wird entweder durch Kochen mit Barytwasser \u00f6der durch Kochen des Harns ohne Zusatz bewerkstelligt; im ersteren Falle hat man den Vorteil der rascheren und vollst\u00e4ndigeren \u00dcberf\u00fchrung und der Zerst\u00f6rung eines Teiles des \u00fcbersch\u00fcssigen Harnstoffes, jedoch die Gefahr des Verlustes an Uramidos\u00e4ure bei zu langem Kochen. Im zweiten Falle dauert die \u00dcberf\u00fchrung l\u00e4nger und ist weniger vollst\u00e4ndig, doch ist die Gefahr eines Verlustes an einmal gebildeter Uramidos\u00e4ure sehr viel geringer und es fallen, da kein Baryt vorhanden ist, Filtrationen weg. 100 ccm oder nach Belieben ein gr\u00f6\u00dferes Volum Harn (wobei man die Zunahme der Harnstoffmenge ber\u00fccksichtigen mu\u00df) werden am Wasserbade stark eingeengt; je nachdem nun der eine oder der andere Modus der \u00dcberf\u00fchrung in die Uramidos\u00e4ure gew\u00e4hlt wird, ist etwa wie folgt vorzugehen. .","page":152},{"file":"p0153.txt","language":"de","ocr_de":"Isolierung von Leucin und Aminos\u00e4uren aus K\u00f6rperfl\u00fcssigkeiten 153\nDer Abdampfr\u00fcckstand wird mit nicht zu viel (es h\u00e4ngt dies nat\u00fcrlich von der Harnmeuge ab) \u00dfarylwasser aufgenommen und mehrere Stunden unter Beachtung der schon angegebenen Umst\u00e4nde gekocht; will man mit Salzs\u00e4ure anhydrisieren, so f\u00e4llt man den \u00fcbersch\u00fcssigen Baryt mit Kohlens\u00e4ure aus ; bei Anhydrisierung mit Schwefels\u00e4ure kann man direkt mit dieser ans\u00e4uren, nur mu\u00df dabei bedacht werden, da\u00df ein gleichzeitiges Ausfallen von Uramidos\u00e4ure mit dem. schwelfelsauren Baryt kaum zu bemerken ist.\nWill man ohne Verwendung von \u00dfarylwasser Vorgehen, so wird der Abdampfr\u00fcckstand mit wenig Wasser aufgehommen und im offenen Kolben stundenlang gekocht ; meist ist es notwendig, nach' einiger Zeit infolge starken Sto\u00dfens, welches durch einen ausfallenden Niederschlag bedingt ist, zu filtrieren. Da das Kochen bei kleinem Volum im offenen Kolben st\u00e4ndige \u00dcberwachung erfordert, so ist es zweckm\u00e4\u00dfig, das Kochen am R\u00fcckflu\u00dfk\u00fchler vorzunehmen, jedoch so, da\u00df man zur Wegf\u00fchrung des sich bildenden Ammoniaks einen W\u00e4sserstoffstr\u00f6m durch die kochende Fl\u00fcssigkeit leitet. Nach' Unterbrechung des Kochens kann sich sofort die Anhydrisierung anschlie\u00dfen. Bez\u00fcglich derselben sei auf das in der Vorhergehenden Abhandlung Gesagte verwiesen. Da das lange Kochen mit S\u00e4uren im Harn starke F\u00e4rbungen hervorruft, so entf\u00e4rbt man zweckm\u00e4\u00dfig vor der \u00c4therextraktion mit Tierkohle in der Siedehitze, wobei man einen nach der Anhydrisierung eventuell ausgefallenen Niederschlag vorher abfiltriert. Die, Gewinnung des Anhydrids mit \u00c4ther wird durch wiederholte Aussch\u00fcttelungen oder mit Hilfe eines Extraktionsapparates von kleineren Dimensionen (50\u2014100 ccm Fassungsraum) bewerkstelligt.\nFolgende Beispiele m\u00f6gen das Gesagte illustrieren. Zu 100 ccm Harn wurden 0,1 g Tyrosin gesetzt und auf dem Wasserbade auf ein kleines Volum eingeengt. Hierauf wurde mit Barytwasser verd\u00fcnnt, die Fl\u00fcssigkeit in einen kleinen Kolben \u00fcbertragen, noch etwas Harnstoff z\u00fcgesetzt und 2 Stunden im Sieden erhalten. Hierauf wurde der Baryt mit Kohlens\u00e4ure entfernt, das Filtrat mit Salzs\u00e4ure stark anges\u00e4uert und am Wasserbade eingedampft. Nach dem Verd\u00fcnnen und Entf\u00e4rben","page":153},{"file":"p0154.txt","language":"de","ocr_de":"154\nF. Li ppich.\nmit Tierkohle wurde viermal mit immer neuen Portionen \u00c4ther ausgesch\u00fcttelt ; nach Abdestillieren des \u00c4thers hinterblieb ein gelblich gef\u00e4rbter R\u00fcckstand, der starke Millonsche Reaktion gab. Er wurde aus kochendem Wasser unter Zusatz von etwas Tierkohle umkrystallisiert ; beim Erkalten schieden sich sch\u00f6ne, wei\u00dfe, nadelf\u00f6rmige Krystalle ab; diese zeigten alle Eigenschaften des Tyrosinurids (Hydantoin der \u00df-p-Oxyphenyl-a-uramido-propions\u00e4ure); ihr Schmelzpunkt im geschlossenen kapillarrohr lag bei 245\u2014247 Ganz \u00e4hnlich verlief ein anderer Versuch, bei dem unter sonst gleichen Verh\u00e4ltnissen der tyrosinhaltige Harn f\u00fcr sich ohne Zusatz von Barytwasser gekocht wurde: anhydrisiert wurde mit Schwefels\u00e4ure. 100 ccm Harn mit 0,2 g Tyrosin und 0,1 g Leucin wurden wie vorher am Wasserbade stark eingeengt, der R\u00fcckstand mit Barytwasser aufgenommen und nach Zusatz von etwas Harnstoff 3 Stunden gekocht. Nach Entfernung des Baryts mit Kohlens\u00e4ure wurde durch zweist\u00fcndiges Kochen mit Salzs\u00e4ure anhydrisiert, mit Tierkohle entf\u00e4rbt, die Tierkohle einmal ausgekocht, die vereinigten Filtrate etwas eingeengt und sechsmal mit \u00c4ther ausgesch\u00fcttelt. Schon vor dem Aussch\u00fctteln hatten sich aus der salzsauren Fl\u00fcssigkeit Krystallnadeln ausgeschieden, die abfiltriert worden waren; sie gaben starke Tyrosinreaktion. Der nach Abdestillieren des \u00c4thers verbliebene R\u00fcckstand wurde zun\u00e4chst mit Chloroform behandelt, wobei ein Teil in L\u00f6sung ging. Der nicht l\u00f6sliche Anteil war fast wei\u00df; er zeigte die Eigenschaften des Tyrosinurids ; sein Schmelzpunkt lag trotz des Nichtumkrystallisierens ganz nahe dem angegebenen von 245\u00b0, doch erfolgte das Schmelzen nicht so scharf wie bei der ganz reinen Substanz. Die Chloroforml\u00f6sung gab einen R\u00fcckstand, der noch eine m\u00e4\u00dfige Tyrosinreaktion zeigte ; er wurde mit wenig Wasser aufgenommen und die w\u00e4sserige\nL\u00f6sung sechsmal mit Chloroform ausgesch\u00fcttelt; der nunmehr erhaltene R\u00fcckstand wog 0,09 g ; er gab eine kaum merkliche Tyrosinreaktion und zeigte alle Eigenschaften des Leucinurids ;\nsein Schmelzpunkt lag bei 210\u00b0. Die erhaltene Menge Leucin-\nDieses Beispiel zeigt wohl zur Gen\u00fcge den Wert und die","page":154},{"file":"p0155.txt","language":"de","ocr_de":"Isolierung von Leucin und Aminos\u00e4uren. aus K\u00f6rperfl\u00fcssigkeiten. 155\nVorz\u00fcge der neuen Methode, so da\u00df es diesbez\u00fcglich keiner weiteren Hinweise bedarf. Bez\u00fcglich der \u00c4therextraktion \u2022 sei nochmals erw\u00e4hnt, da\u00df sie auch in einem Extraktionsapp\u00e4rat erfolgen kann; letzterer wird besonders dann zu verwenden sein, wenn im Wasser leichter l\u00f6sliche Anhydride wie Valin-urid und besonders Alanurid zu isolieren sind. Denn nur so kann man auch die letzteren ann\u00e4hernd quantitativ gewinnen, was z. B. bei F\u00fctterungsversuchen mit Aminos\u00e4uren von besonderer Bedeutung ist, wenn es gilt, den eventuell unver\u00e4ndert in den Harn \u00fcbergegangenen Anteil zu bestimmen, oder nach* zuweisen, ob und in welchem Umfange Uramjdos\u00fcurebildung stattgefunden hat.\t\u2019\t\u2022\nZum Schl\u00fcsse m\u00f6chte ich noch hervorheben, da\u00df ich mit diesen Mitteilungen die Versuche keineswegs f\u00fcr abgeschlossen erachte. Insbesondere sollen noch nach der quantitativen Seite hin, ferner in bezug auf die Trennung von Amido-s\u00e4uren der Glykokollreihe und bez\u00fcglich des Nachweises von Glykokoll, Asparagins\u00e4ure und Glutamins\u00e4ure, derfen Anhydride f\u00fcr die Isolierung durch \u00c4ther, wie schon erw\u00e4hnt, nicht in Betracht kommen, weitere Versuche angestellt werden.\nIch gehe nun zu den Versuchen \u00fcber, welche die Anwendung der \u00fcramidos\u00e4urereaktion auf das Blut bezwecken.\nEs ist von vornherein klar, da\u00df die Isolierung gr\u00f6\u00dferer Mengen (was unter diesen \u00ab gr\u00f6\u00dferen Mengen\u00bb zu verstehen ist, zeigen die beim Harn angef\u00fchrten Beispiele) von Amid\u00f6s\u00e4uren, eine sorgf\u00e4ltige Enteiwei\u00dfung vorausgesetzt, hier nach den beschriebenen Methoden ebenso einfach ist wie im Harn, ja sogar insofern noch besser durchgef\u00fchrt werden kann, als neben dem Eiwei\u00df die Konzentration der \u00fcbrigen Substanzen eine geringe ist, so da\u00df hier der gro\u00dfe Salz- un# Harnstpff-\u00fcberschu\u00df wegf\u00e4llt, da\u00df ferner dieser Umstand ein viel st\u00e4rkeres\nKonzentrieren der Aminos\u00e4ure in einem bestimmten Volum\nund auch insofern gestattet, als gr\u00f6\u00dfere Volumina auf einmal, ohne besondere Komplikationen seitens der sich anh\u00e4ufenden \u00fcbrigen Substanzen, verarbeitet werden k\u00f6nnen. Dies gilt, immer gr\u00f6\u00dfere Mengen von Aminos\u00e4uren vorausgesetzt, nat\u00fcrlich in gleicher Weise auch f\u00fcr andere normale Und patho-","page":155},{"file":"p0156.txt","language":"de","ocr_de":"156\tF. Lippich,\nlogische K\u00f6rperfl\u00fcssigkeiten wie Speichel, Milch, Ascites-,Cystenfl\u00fcssigkeiten usw.\nMir kam es also vor allem darauf an, festzustellen, welche Empfindlichkeit der Reaktion in einem bestimmten Falle zu erzielen ist. ln diesem Sinne wurden die Versuche mit Blut, resp. Serum angestellt; nat\u00fcrlich kann die zu diesem Zwecke gewonnene Methode auch zur Isolierung gr\u00f6\u00dferer Aminos\u00e4uremengen verwendet werden, doch werden dann gegebenen Falles Vereinfachungen m\u00f6glich sein. Es wurde folgenderma\u00dfen verfahren.\t- . \u2019\t' _\t'\n100 ccm Kinderserum, dem 0,01 g Leucin zugesetzt waren, wurden mit dem gleichen Volum ges\u00e4ttigter Ammonsulfatl\u00f6sung versetzt und die Fl\u00fcssigkeit auf ein Liter aufgef\u00fcllt. Nach ganz schwachem Ans\u00e4uern mit Essigs\u00e4ure wurde in der Siedehitze koaguliert, hei\u00df filtriert und das Koagulum ausgekocht; die vereinigten Filtrate wurden sodann durch Barythydrat von der Schwefels\u00e4ure, durch Kohlens\u00e4ure vom Baryt befreit; die entsprechenden Niederschl\u00e4ge wurden jedesmal abzentrifugiert. Die Fl\u00fcssigkeit wurde sodann an der Wasserstrahlpumpe zur Trockene verdunstet; Der R\u00fcckstand wurde mit Wasser aufgenommen, filtriert, durch Zusatz von Schwefels\u00e4ure auf einen Gehalt von 5\u00b0/o an derselben gebracht und mit Phosphorwolframs\u00e4ure ' ausgef\u00e4llt. Nach Entfernung der letzteren mit Baryt und des Baryts mit Kohlens\u00e4ure wurde das Filtrat am Wasserbade zur Trockene verdampft, der R\u00fcckstand mit Wasser aufgenommen, nochmals filtriert und das Filtrat neuerlich verdampft. Nun wurde mit m\u00f6glichst wenig Wasser aufgenommen und die L\u00f6sung in einer kleinen mit Steigrohr versehenen Eprouvette in der Weise, wie es in der vorhergehenden Abhandlung beschrieben wurde, 1 Stunde lang nach Zuf\u00fcgen von Harnstoff erhitzt. Beim Ans\u00e4uren mit Salzs\u00e4ure wurde ein relativ reichlicher aus Nadeln bestehender, \u00e4therbest\u00e4ndiger Niederschlag erhalten. Gleichzeitig mit dieser Probe waren in genau derselben Weise zwei weitere Proben mit je 100 ccm desselben Serums ausgef\u00fchrt worden, das eine-mal ohne Leucinzusatz, im anderen Falle nach Zusatz von 0,005 g Leucin. Beide Proben fielen negativ aus. Es wurde","page":156},{"file":"p0157.txt","language":"de","ocr_de":"Isolierung von Leucin und Aminos\u00e4uren aus K\u00f6rperfl\u00fcssigkeiten. 157\nnun versucht, unter Anwendung verschiedener Enteiwei\u00dfungsmethoden und unter verschiedenen sonstigen Modifikationen die Empfindlichkeit der Reaktion auf den sicheren Nachweis von 5 mg in 100 ccm zu steigern, ohne dabei gr\u00f6\u00dfere Ser\u00fcm-mengen als 100 ccm zu verwenden, weil ja in Praxi h\u00e4ufig genug bei solchen Untersuchungen keine gr\u00f6\u00dferen .Blutmengen zur Verf\u00fcgung stehen. Leider gelang es bisher nicht, das gesteckte Ziel befriedigend zu erreichen, was m\u00eet Bezug auf gewisse Fragen, besonders bez\u00fcglich des \u00dcberganges resp. Auftretens freier Aminos\u00e4uren im Blute Von besonderer Wichtigkeit gewesen w\u00e4re. Es scheint, da\u00df gerade das Eiwei\u00df bei der Koagulation Leucin mitrei\u00dft. M\u00f6glicherweise f\u00fchrt noch die Dialyse oder die Ultrafiltration zum Ziele, Vielleicht gen\u00fcgt schon die bis jetzt erreichte Empfindlichkeit zur Entscheidung mancher Fragestellungen; jed\u00e8nfalls werden diese Untersuchungen fortgesetzt werden.","page":157}],"identifier":"lit37431","issued":"1914","language":"de","pages":"145-157","startpages":"145","title":"\u00dcber die Isolierung von Leucin und anderen Aminos\u00e4uren aus K\u00f6rperfl\u00fcssigkeiten","type":"Journal Article","volume":"90"},"revision":0,"updated":"2022-01-31T16:45:43.288917+00:00"}